纳米探针技术在化学发光法检测肿瘤细胞中的应用

张瑞腾

（山西医科大学晋祠学院，山西太原030025）

肿瘤是生物基体的某些局部组织受到致癌因素的影响而在基因手绘屏上失去了其正常生长调控能力，从而表现为克隆性异常增长的新的细胞组织。肿瘤发病率与生物体自身基因组成和生活环境息息相关，人们日常接触到的食品、大气、土壤、饮用水、辐射等都可能是造成肿瘤的因素。根据世界卫生组织统计调查，80%以上的恶性肿瘤均可以通过提高体检频率来避免并且及时治疗。因此，积极的诊断是治疗肿瘤的重要手段。肿瘤标志物会伴随肿瘤的生长而分泌，可以应用生物学、免疫化学检测原料进行标定，并由临床肿瘤医院提供相关诊断和治疗检测信息。通常肿瘤标志物处于肿瘤细胞和组织之间，可以通过血液等体液进入到人体其他组织中。且当肿瘤细胞处于不同的生长期时，其表现出的肿瘤标志物也有明显的差异性。因此临床医疗可以通过对肿瘤标志物的定性、定量检测来提高对肿瘤的诊断和监测，从而获得治疗所需要的信息。检测信息可以帮助医生判断肿瘤患者是否需要进行切割手术和满足保守治疗条件，治疗中应使用何种级别药物及使用剂量等。因此，技术研究人员不断探索开发更先进、更全面、更灵敏的肿瘤细胞检测技术是非常重要的。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

人工合成寡聚核苷酸由生工生物工程（上海）有限公司提供（定义为DNA1DNA2DNA3DNA4）；氢氧化钠、咪唑、四氯金酸、盐酸、磷酸二氢钠、N-羟基琥珀酰亚胺、磷酸氢二钠、4,4二羧基-2,2-连吡啶等药品由国药化学试剂公司和阿拉丁化学试剂公司提供，纯度均为分析纯。

实验使用的电致化学发光分析仪，采购于西安瑞迈电子科技公司，型号为MPI-E；

1.2 肿瘤细胞培养

培养的肿瘤细胞为Ramos细胞（CRL-1596，淋巴瘤细胞），由中国医学科学院提供。细胞培养液中青霉素-链霉素含量为60 IU/mL，胎牛血清含量为10%；培养温度为37℃，环境中二氧化碳含量为5%。抽取肿瘤细胞样品的步骤为：使用Petroff-Hausser细胞计数板对淋巴瘤细胞数量进行计量统计，抽取1.0 mL细胞培养液，在高速离心机下离心分离，倒掉离心管内上层营养液，使用磷酸盐缓冲溶液对离心管下层的肿瘤细胞组织进行反复冲洗。冲洗结束后将肿瘤细胞组织分散在磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中。

1.3 LA/SP/Fe3O4@Au复合物制备

1.3.1 [Ru(bpy)2(dcbpy)]-DNA信号探针制备

使用三氯化钌和2,2-联吡啶为原料，以乙二醇为反应介质，在圆底烧瓶中反应，得到的氯化二联吡啶钌中间体用丙酮和乙醚苯萃取洗涤。以氯化二联吡啶钌中间体与碳酸氢钠、4,4二羧基-2,2-连吡啶为原料，以甲醇/水为反应介质，在圆底烧瓶中加热回流反应。反应结束后在体系中加入一定量的六氟磷酸钠，得到棕褐色的二联吡啶-4,4-二羧酸-2,2-联吡啶合钌六氟磷酸盐沉淀。以N,N-二甲基甲酰胺为反应介质，以二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和二联吡啶-4,4-二羧酸-2,2-联吡啶合钌六氟磷酸盐为原料在圆底烧瓶中反应，最终得到[Ru(bpy)2(dcbpy)]探针物质。配置DNA超纯水溶液并加入一定体积0.584 mmol/L的[Ru(bpy)2(dcbpy)]探针物质和四硼酸缓冲溶液，搅拌均匀后再加入一定体积醋酸钠溶液和无水乙醇试剂，在冰浴条件下修饰反应30 min。反应结束后使用高速离心机分离，并用低温乙醇试剂洗涤沉淀物后干燥，得到的[Ru(bpy)2(dcbpy)]-DNA放入到PBS缓冲溶液中备用。

1.3.2 Fe3O4@Au磁性纳米核壳结构材料制备

使用柠檬酸钠还原四氯金酸的方法制备纳米金粒子。使用商品磁珠进行巯基修饰，修饰后分散在TCEP溶液中老化1 h后加入自制的纳米金粒子悬浮液，继续震荡老化反应12 h。反应结束后用使用PBS缓冲溶液冲洗，干燥，得到Fe3O4@Au磁性纳米核壳结构材料。

1.3.3 LA/SP/Fe3O4@Au复合物制备

[Ru(bpy)2(dcbpy)]-DNA探针溶液置于TCEP溶液中老化1h后加入Fe3O4@Au磁性纳米核壳结构材料溶液混合，连续搅拌16h以上，随后继续加入0.3 mmol/L氯化钠和10 mmol/L Tris-乙酸溶液继续老化48 h。反应结束后通过磁性分离手段脱除结合的探针，得到LA/SP/Fe3O4@Au复合物。

2 肿瘤检测结果

将生物素修饰的c-DNA自组装到链霉亲合素表面并与自制的LA/SP/Fe3O4@ Au复合物杂交，然后加入一定数量的淋巴肿瘤细胞。随着细胞表面蛋白与复合物的核酸适配体发生特异性结合反应，部分LA/SP/Fe3O4@Au复合物会脱离链霉亲合素而进入到溶液中，使用DNA2和DNA4将肿瘤细胞表面的复合物探针继续解离到溶液中。最后通过磁性金电极捕获溶液中的复合物探针并进行电致化学发光检测，检测结果如图1和图2所示。

从图1曲线可以看出，当肿瘤细胞数量从1 000增加到100 000时，体系中的电致化学发光强度成增加趋势。以肿瘤细胞数量为横坐标，强度曲线的峰值为纵坐标绘制拟合曲线，发现二者成线性关系。通过origin软件拟合计算得到拟合方程为I=-858.747+292.8031lgC，其中I为电致化学发光强度，C为淋巴肿瘤细胞数量。拟合方程的线性度为0.999 8，说明可以根据建立的拟合曲线，通过电致化学发光强度数值计算得到肿瘤细胞的数量，进行肿瘤细胞检测。

3 结论

本文制备了一种LA/SP/Fe3O4@ Au复合物探针，采用磁性电极将解离出的探针进行富集，结合电致化学发光检测方法，以淋巴肿瘤细胞组织液为样品，建立了一种灵敏度高的肿瘤细胞检测方法。建立的拟合方程为I=-858.747+292.8031lgC，线性度为0.9998。

图1 不同数量淋巴肿瘤细胞下从链霉亲合素上解离出的纳米复合物探针的电致化学发光信号动力学曲线

图2 不同淋巴肿瘤细胞数量下电致化学发光信号峰高与细胞数量的关系