一株异养硝化-好氧反硝化地衣芽孢杆菌的脱氮特性及机制研究❋

赵 坤， 田相利，2❋❋， 董双林，2， 蒋雯雯， 李海东

(1海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学)，山东 青岛 266003；2.青岛海洋科学与技术试点国家实验室，山东 青岛 266237)

本研究中，分别以氯化铵、亚硝酸钠和硝酸钠作为唯一氮源，对一株分离自对虾养殖池塘底泥的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)菌株MP15的脱氮特性进行了详细的研究。与此同时，通过测定菌株MP15脱氮过程中的关键酶活性，从酶学角度理解其脱氮途径。此外，本研究采用高精度的气相色谱-同位素比质谱(GC-IRMS)同位素示踪技术，研究菌株MP15的氮代谢路径，旨在阐明菌株MP15的异养硝化-好氧反硝化机制，为其在生物脱氮实践应用中提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 本研究中所用的地衣芽孢杆菌菌株MP15分离自对虾养殖池塘底泥，目前保藏于中国海洋大学水产养殖生态实验室微生物保藏中心。菌株MP15的16S rRNA基因序列的GenBank登记号为MH569340[35]。

1.1.2 培养基 2216E培养基：胰蛋白胨 6.0 g、酵母提取物 2.0 g、海水1 000 mL，pH=7.5。

异养硝化培养基(HNM)：NH4Cl 0.16 g，葡萄糖1.73 g，海水1 000 mL，pH=7.5。

亚硝酸盐反硝化培养基(NDM)：NaNO20.20 g，葡萄糖1.73 g，海水1 000 mL，pH=7.5。

硝酸盐反硝化培养基(DM)：NaNO30.26 g，葡萄糖1.73 g，海水1 000 mL，pH=7.5。

上述HNM、NDM和DM培养基，使用前分别于高压灭菌锅115 ℃下高温蒸汽灭菌20 min；2216E培养基使用前于高压灭菌锅121 ℃下高温蒸汽灭菌20 min。

1.2 菌株MP15异养硝化-好氧反硝化性能研究

1.3 对菌株MP15氨氧化过程的抑制研究

1.4 菌株MP15脱氮过程中关键酶活性研究

1.5 15N同位素示踪测定含氮气体研究

在本实验中，分别用15NH4Cl、Na15NO2和Na15NO3(Sigma Corp., USA)替代上述基础降解液中的NH4Cl、NaNO2和NaNO3。其中以不添加菌液的基础降解液作为对照组，以添加菌液的不同氮基础降解液作为不同的实验组，每个实验组设置3个重复。取对数期的菌液，按照5%(v:v)的接种量，接种于含有100 mL无菌基础降解液的500 mL用橡皮塞紧密密封的医用输液瓶中[7]，然后将各处理置于恒温(28 ℃)摇床连续振荡(160 r/min)培养72 h。实验结束后，检测顶空气体中氮的气体化合物。样品的稳定同位素比值是在深圳市华科精信检测科技有限公司与清华大学深圳研究生院共建的稳定同位素实验室测定，仪器型号为同位素比率质谱仪(Thermo Fisher Finnigan DELTA V Advantage，美国)。氮稳定同位素的自然丰度表示为:

式中：N为样品15N；R为15N/14N；δ15N是相对于N2-atm，分析精度为δ15N<0.3‰。

1.6 实验方法和计算

1.7 统计分析

实验数据以平均值±标准差(Means±SD)表示。数据使用SPSS(SPSS 19.0 version for windows，SPSS，Inc.，Chicago，USA)进行统计分析。通过Kolmogorov-Smirnov检验和Levene’s检验进行数据的正态分布检测。若数据符合正态分布，则进行进一步的分析，若不符合，则首先进行数据转换。通过单因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比较，对实验数据进行比较分析以P<0.05表示各组间存在显著性差异。

2 实验结果

2.1 异养硝化-好氧反硝化性能

图1 地衣芽孢杆菌MP15以氯化铵作为唯一氮源时的脱氮特性Fig. 1 Nitrogen removal characteristic of B. licheniformis MP15 with ammonium chloride served as the sole N-source

图2 地衣芽孢杆菌MP15以亚硝酸钠作为唯一氮源时的脱氮特性Fig. 2 Nitrogen removal characteristic of B. licheniformis MP15 with sodium nitrite served as the sole N-source

图3 地衣芽孢杆菌MP15以硝酸钠作为唯一氮源时的脱氮特性Fig. 3 Nitrogen removal characteristic of B. licheniformis MP15with sodium nitrate served as the sole N-source

2.2 菌株MP15的氨氧化过程抑制

(图4A为基础降解液中和TN的浓度变化；图4B为氧化过程NH2OH的浓度变化。Fig. 4A, Change of and TN concentrations in different culture media; Fig. 4B,Change of concentration of NH2OH during ammonium oxidation.)

2.3 菌株MP15脱氮过程中关键酶活性

对菌株MP15脱氮过程中关键酶活的测定主要包括粗酶液中的硝酸盐还原酶(Nar)、亚硝酸盐还原酶(Nir)和羟胺氧化还原酶(Hao)，测定结果见表1。在菌株MP15脱氮过程中，Nar、Nir和Hao均具有一定量的表达，在粗酶液中，检测到菌株MP15的Nar、Nir和Hao的酶比活力分别为0.160 9、0.157 8和0.540 6 U/mg。

表1 地衣芽孢杆菌MP15的脱氮关键酶活性Table 1 Key enzyme activity of B. licheniformis MP15

2.4 15N同位素示踪测定含氮气体

表2 地衣芽孢杆菌MP15在不同氮基础降解液中15N2和15N2O的GC-IRMS检测结果Table 2 GC-IRMS results of 15N2 and 15N2O of B. licheniformis MP15

3 讨论

综合菌株M15在不同无机氮基础降解液中的脱氮特性、脱氮过程中的关键酶活性以及脱氮过程中的15N同位素示踪，菌株MP15具有高效的同步硝化-反硝化性能，其对无机氮的去除主要包括同化作用、硝化作用和反硝化作用。通过对异养硝化-好氧反硝化菌株MP15的脱氮特性和脱氮机制研究，将有助于其在生物脱氮和生物修复中的实践应用。

4 结语