热聚集对β-乳球蛋白消化行为及消化产物的抗氧化性的影响

林展拓，高志明,2,，杜徐楠，陈改亭，胡 猛，方亚鹏,2,，汤 虎

（1.湖北工业大学菲利普斯亲水胶体研究中心，湖北 武汉 430068；2.湖北工业大学 工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068；3.中国农业科学院油料作物研究所，湖北 武汉 430068）

食物的抗氧化活性对人体健康有着重要意义。当人体利用氧气进行某些代谢反应时，会产生活泼的自由基，该自由基能导致人类超过100 种疾病，包括动脉粥样硬化、关节炎、中枢神经系统损伤、胃炎、癌症和急性艾滋病等[1]。因此，增加食物的抗氧化活性以稳定自由基多余的电子具有重要的作用。有研究表明，一些蛋白质酶解后形成的多肽或者寡肽具有一定的抗氧化性，如大豆蛋白[2-4]、螺旋藻蛋白[5-6]和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）[7-8]等。

蛋白质在不同环境（例如不同温度和酸碱度）下热处理，会形成不同形式的聚集体，这些具有不同结构的蛋白质聚集体在人体胃肠道中具有不同的消化行为。Zhang Sha等[9]在不同pH值下加热乳清蛋白形成了不同聚集体，并发现这些不同的乳清蛋白聚集体在模拟胃液中有不同的消化率。Zhang Jie等[10]通过热处理制备了大豆分离蛋白纳米颗粒聚集体，并对其模拟胃部消化，发现大豆分离蛋白纳米颗粒聚集体的消化率比未经热处理的大豆分离蛋白的消化率高。因此蛋白质的聚集形态对其消化行为有着重要影响。不仅如此，蛋白质的聚集形态还与其消化产物的抗氧化性有一定联系。Lin Suju等[11]在95 ℃下加热乳清蛋白生成聚集体，并对其模拟胃肠道消化，发现乳清蛋白加热生成聚集体后，其消化产物的抗氧化性提高。Wang Xuefen等[12]在不同温度下处理卵白蛋白，并模拟了胃肠道消化，发现在较高温度处理下，卵白蛋白的消化产物中含有更多的抗氧化性肽段。由此可得，不同蛋白质聚集体消化产物的抗氧化性差异明显。

BLG是乳清蛋白的重要组成部分，约占乳清蛋白总量的1/2。BLG的分子质量约为18.3 kDa，等电点是5.1～5.3，含有162 个氨基酸残基[13]。在pH值小于3条件下，BLG具有稳定的球状三级结构，其疏水基团在内部形成高度疏水的“β-桶”结构[14-15]。本实验拟采用BLG作为原料蛋白，根据不同食品加工条件分别制备了纳米颗粒聚集体（BLG nanoparticle aggregates，BLGN）、蠕虫状聚集体（BLG worm-like aggregates，BLGW）和纤维状聚集体（BLG fibril aggregates，BLGF）3 种不同形式的热聚集体，在此基础上研究不同聚集方式对其消化行为和消化产物抗氧化性的影响，为蛋白质食品的设计开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牛奶购于武汉新东杨畜牧养殖专业合作社；胃蛋白酶（酶活力3 000 U/g）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、邻苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸（Gly） 上海麦克林生化科技有限公司；其余试剂均为分析纯级，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

EL204型分析天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司；TU-1900型双光束紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌水浴锅 巩义市予华仪器有限责任公司；JEM-2100（HR）透射电子显微镜 日本电子株式会社；LGJ-12型冷冻干燥机 郑州宏郎仪器设备有限公司；纳升电喷雾离子源-液相色谱-串联质谱（Nanoelectron spray ionization liquid chromatography-tandem mass spectrometry，Nano-ESI-LC-MS/MS）仪 美国赛默飞世尔科技公司；F-7000荧光分光光度计 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 BLG的提取

在每升新鲜牛奶中加入0.5 g NaN3，置于40 ℃水浴锅中加热1 h。待其冷却至室温后，在5 000 r/min下离心30 min以去除乳脂，取其上清液并调节pH值至4.6，静置过夜以沉淀酪蛋白，并在10 000 r/min下离心20 min以除去酪蛋白。接着在每升样液里加入17.64 g柠檬酸三钠和46.2 g柠檬酸以调节样液pH值至3.6～3.7。接着将其置于50 ℃水浴锅中加热2 h后静置过夜。将样液先在4 000 r/min下离心20 min，再在10 000 r/min下离心20 min，离心后取上清液置于50 ℃水浴锅中加热2 h并静置过夜，该过程重复3 次。将得到的样液用0.45 μm水系滤膜抽滤2 次后，用7 000 Da透析袋在4 ℃下透析3 d，然后进行冷冻干燥，得到蛋白质量分数约为96%的BLG粉末。

1.3.2 BLG聚集体的制备

用超纯水配制一定质量浓度的BLG分散液（起始pH值约为7.4），通过0.1 mol/L HCl溶液调节pH值，并在高温下加热一定时间，使BLG形成聚集体，之后迅速转移至冰水浴中冷却。将得到的样液用相同pH值的水透析3 d（每隔2 h换一次水）后冷冻干燥得到BLG聚集体粉末。不同聚集体制备条件[16]如表1所示。

表1 不同BLG热聚集体的制备条件Table 1 Preparation conditions for different BLG thermal aggregates

1.3.3 透射电子显微镜观察

将冻干后的蛋白质热聚集体样品分散在水中配制成0.5 mg/mL的分散液，以60%的功率水浴超声15 min，促进样品分散。接着用移液枪吸取5 μL样品滴至铜网上，自然晾干后用移液枪吸取10 mg/mL的磷钨酸（水浴超声30 min后用0.22 μm水相滤膜过滤）滴至样品表层进行负染，再次晾干后进行透射电子显微镜观察。

1.3.4 表面疏水性的测定

采用ANS荧光探针法测定蛋白质的表面疏水性。配制pH值为2.0、浓度为0.05 mol/L的Gly-HCl缓冲液，将蛋白质样品分散其中，其分散的质量浓度范围为0.05～1.00 mg/mL。配制8 mmol/L的ANS（现配现用，避光），取20 μL加入至2 mL样品分散液中充分混合反应，用荧光分光光度计测量其反应至3 min时的荧光强度。测量参数如下：激发波长λex＝390 nm（狭缝5 nm），发射波长λem＝470 nm（狭缝5 nm）。以样品分散液质量浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作曲线，曲线的斜率即为蛋白质的表面疏水性指数（S0）。

1.3.5 模拟胃部消化

将冻干后的蛋白质聚集体样品分散于超纯水中，配制成1 mg/mL的样品分散液。将样品分散液和配制好的胃蛋白酶液（质量浓度为20 mg/mL）在37 ℃下调节pH值至2.0。将胃蛋白酶液（酶与底物的体积比为1∶1.4）加入样品分散液中，消化3 h后加入一定量的0.1 mol/L碳酸钠溶液（V消化液：V碳酸钠溶液＝9∶1）以灭酶。灭酶后将样品置于4 ℃冰箱低温保存以备用。

1.3.6 蛋白质胃部消化率的测定

参照Chang Cuihua等[17]的实验方法测定1.3.5节灭酶后样品的蛋白质水解度。

OPA试剂的配制：配制40 mg/mL OPA的甲醇溶液，并避光保存。取1.906 8 g四硼酸钠、0.1 g SDS和88 mg DTT于90 mL超纯水中，待其充分溶解后，将OPA的甲醇溶液全部加入其中充分混合，然后全部转移至100 mL棕色容量瓶中定容。

取0.2 mL待测液于1.5 mL的OPA试剂中充分混合反应，用紫外分光光度计测定其反应至2 min时在340 nm波长处的吸光度。其水解度（degree of hydrolysis，DH）按公式（1）计算。

式中：A0、At分别为水解前、水解后的吸光度；M为蛋白质摩尔质量/（g/moL）；ε为摩尔消光系数（6 000 L/（moL·cm)）；ρ为样品质量浓度/（mg/mL）；N为每个分子平均肽键数量。

1.3.7 Nano-ESI-LC-MS/MS分离鉴定消化产物

取1.3.5节中灭酶后的样品10 000 r/min离心10 min，取上清液进行Nano-EsI-LC-MS/MS分离鉴定，其参数和方法参照Wang Xuefen等[12]的实验。将得到的肽段序列放到BIOPEP的Bioactive peptides数据库进行生物活性分析，得到所选肽段中具有抗氧化活性的片段，并进行统计。

1.3.8 抗氧化活性的测定

取1.3.5节中灭酶后的样品10 000 r/min离心10 min，取上清液作为以下实验的样品。

DPPH自由基清除能力测定[18]：将实验分为两组，分别为空白组（A组）和样品组（B组），具体配制方法如下。A组：配制20 mg/L的DPPH乙醇溶液，取其2 mL与2 mL无水乙醇混合，并避光反应30 min后，以无水乙醇作为空白对照，在517 nm处测其吸光度；B组：将A组中2 mL无水乙醇换成2 mL样品，其余操作一致。DPPH自由基清除能力通过公式（2）计算。

式中：AA为A组溶液的吸光度；AB为B组溶液的吸光度。

羟自由基清除能力的测定：参照Venkatachalam等[1]的实验方法进行改进。该实验分成3 组，分别是空白组、样品组和对照组，具体配制方法如下。空白组：配制8.8 mg/mL过氧化氢溶液、9 mg/L水杨酸乙醇溶液和9 mg/L硫酸亚铁溶液，均取2 mL并将其充分混合后，加入2 mL超纯水，37 ℃水浴反应30 min，然后在562 nm波长处测其吸光度；样品组：将空白组中的超纯水换成样品分散液，其余操作一致。对照组：6 mL超纯水与2 mL样品混合均匀，在37 ℃水浴反应30 min，然后在562 nm波长处测吸光度；所有样品均用超纯水稀释一定倍数使吸光度在0.2～0.8范围内，样品中的羟自由基清除活性按公式（3）计算。

式中：A0为空白组溶液的吸光度；A1为样品组溶液的吸光度；A2为对照组溶液的吸光度。

超氧阴离子自由基清除能力的测定：该实验分为2组，分别为样品组（A组）和空白组（B组），具体配制方法如下。A组：配制pH 8.2、50 mg/L的Tris-HCl缓冲液，取其4.5 mL并加入4 mL超纯水，再加入0.2 mL样品分散液混合均匀。然后在25 ℃反应10 min后加入0.3 mL 3 mg/mL的邻苯三酚溶液（邻苯三酚用10 mmol/L HCl溶液溶解）混匀，在320 nm波长处测吸光度，每30 s测一次，测到5 min；B组：将A组中的样品分散液换成超纯水，其余操作一致。样品的超氧阴离子自由基清除活性按公式（4）计算。

式中：k0为溶液B在5 min内吸光度变化的斜率；k1为溶液A在5 min内吸光度变化的斜率。

还原能力的测定[19]：配制pH 6.6、50 mg/mL的磷酸盐缓冲液与10 mg/mL的铁氰化钾，均取2 mL充分混合后，加入2 mL样品混合均匀。在50 ℃反应20 min，然后加入2 mL 100 g/L的三氯乙酸溶液，静置1 h后在5 000×g下离心10 min，取2.5 mL上清液与0.5 mL 1 mg/mL的三氯化铁和2.5 mL超纯水混合均匀，反应10 min，在700 nm波长处测定反应液的吸光度，吸光度越高，代表还原能力越强。

1.4 数据统计分析

所有实验均重复3 次，利用SPSS软件进行单因素方差分析，P＜0.05时为显著性差异，并用Origin 8.0、MATLAB等软件处理数据并制图。

2 结果与分析

2.1 BLG及其聚集体形貌

图1 BLG及其聚集体的透射电子显微镜图Fig. 1 Transmission electron micrographs of BLG and its aggregates

图1 A是pH 5.8、85 ℃下加热15 min得到的BLGN，从图2A中可以看出BLGN粒径为200 nm左右。Hoffmann等[20]在相同条件下制备的BLGN粒径为170 nm左右，与本实验观察结果相近。图1B是在pH 7.0、85 ℃下加热15 min得到的BLGW，从图2B中可以看出BLGW的长度在60～225 nm之间，与Schmitt等[21]报道的结果相似。图1C是在pH 2.0、80 ℃下加热16 h形成的BLGF，从图2B中可以看出BLGF的长度在300～1 000 nm之间，由于经过冻干和重新分散，这些聚集体的长度分布较宽。Adamcik等[22]通过原子力显微镜表征了蛋白质纳米纤维的精细结构，认为蛋白质纳米纤维最初形成“原纤维”即单股聚集体，然后经过螺旋缠绕逐步形成多股螺旋结构，形成成熟的纳米纤维。图1D是未变性的BLG，从图2A中可以看出BLG是粒径为3 nm左右的球状颗粒，这与报道的结果[13,16]一致。

图2 BLG及其聚集体的粒径或长度分布Fig. 2 Particle size or length distribution of BLG and its aggregates

2.2 不同聚集体表面疏水性

图3 BLG及其聚集体的表面疏水性Fig. 3 Surface hydrophobicity of BLG and its aggregates

如图3所示，BLG及其聚集体的表面疏水性大小依次为BLGN＞BLGW＞BLGF＞BLG，三种不同聚集体的表面疏水性均大于BLG本身，说明热聚集能导致BLG的表面疏水性增加，这与Nicolai等[16]报道的结果相似。根据该报道，蛋白质加热温度超过80 ℃后，内部疏水基团暴露并发生聚集，提高了表面疏水性。由此可见，不同条件制备的BLG聚集体，表面疏水性不同。

2.3 热聚集对水解度的影响

表2 模拟胃液中BLG及其聚集体的水解度Table 2 Hydrolysis degree of BLG and its aggregates in simulated gastric fluid

如表2所示，BLGN、BLGW、BLGF和BLG在模拟胃液中的水解度分别为（11.86±0.24）%、（10.55±0.22）%、（9.08±0.21）%和（3.46±0.16）%，差异显著。BLG的水解度较其他3 种聚集体要低得多，根据Nicolai等[16]的报道，是因为BLG独特的“β-桶”结构，使得疏水基团被掩埋在BLG结构内部，胃蛋白酶的作用位点较少，导致水解度偏低。BLGN、BLGW、BLGF和BLG的水解度从大到小依次为BLGN＞BLGW＞BLGF＞BLG，该结果与其表面疏水性呈正相关。Zhang Sha等[9]等曾在乳清分离蛋白的消化研究中得到过类似的结果。该报道分别在pH 3.0、6.0、7.0，85 ℃下加热30 min制备了不同的热聚集体并模拟胃部消化实验，发现3 种pH值下制备的聚集体水解率从大到小依次为pH 6.0＞pH 7.0＞pH 3.0。Coligan等[23]发现胃蛋白酶主要作用于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸等疏水性氨基酸残基，这些残基是形成表面疏水性的原因。因此这三种聚集体在胃液中的水解率与表面疏水性有关，表面疏水性越强，水解率越高。

2.4 消化产物的Nano-ESI-LC-MS/MS分离鉴定

图4 BLG及其聚集体消化产物中鉴定到的肽段的种类Fig. 4 Molecular mass distribution of peptides identified in the digestion products of BLG and its aggregates

从BLGN、BLGW、BLGF和BLG的消化产物中分别鉴定到170、156、189、154 种肽段，肽段种类与水解度之间的相关性不明显。有可能是因为本实验条件下的分子质量鉴定范围为700～5 000 Da，BLGN和BLGW因水解度高，产生了更多分子质量低于700 Da的寡肽甚至氨基酸，因此难以鉴定。

根据分子质量不同，将4 种样品消化产物分成了700～1 500、1 500～3 000 Da和3 000～5 000 Da三组。由图4可知，经胃蛋白酶消化后，鉴定到3 000～5 000 Da组肽段种类都最少，1 500～3 000 Da组肽段种类居中，700～1 500 Da组肽段种类最多，说明四种样品消化后均生成了低分子质量肽段，且种类较多。对于700～1 500 Da组，其肽段种类从多到少依次为BLGN＞BLGW＞BLGF＞BLG，分别为109、108、102和100。说明BLGN水解率高，多肽链水解更充分，形成的低分子质量肽段相应增多，该结果与2.3节中的水解度吻合。对于1 500～3 000 Da组，BLG及其不同聚集体消化产物中的肽段种类从多到少依次为BLGF＞BLG＞BLGN＞BLGW，分别为69、45、43和37。纤维聚集体消化后得到的中链肽段最多，可能是小分子质量肽段重新组装的结果。Bateman等[24]发现BLGF被水解后会自组装形成新的肽链，因此导致分子质量增加。对于3 000～5 000 Da组，BLGN、BLGW、BLGF和BLG消化后的产物中鉴定到的肽段种类分别为18、11、18和9。BLG鉴定到的肽段种类最少可能是因为仍有许多未水解的肽段分子质量大于5 000 Da，导致鉴定不到。

图5 BLG及其聚集体消化产物中鉴定到的肽段的维恩图Fig. 5 Venn diagram of peptides identified in the digestion products of BLG and its aggregates

图5 直观地显示了BLG及其不同聚集体的消化产物的共有肽段和独有肽段。BLG及其聚集体的消化产物中有90 种共有肽段，这表明这些肽段在BLG热聚集过程中不受温度和pH值影响。在各消化产物中，BLGN有14 种独有肽段，BLGF有59 种独有肽段，BLGW有13 种独有肽段，BLG有21 种独有肽段。说明不同聚集方式对BLG的消化产物具有显著影响。

Bromley[25]、Hernández-Ledesma[26]等发现氨基酸序列为WYSLAMA（色氨酸-酪氨酸-丝氨酸-亮氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-丙氨酸）和HMIRL（组氨酸-蛋氨酸-异亮氨酸-精氨酸-亮氨酸）的肽链具有很强的抗氧化活性，如果肽链中含这些序列，则该肽段可能具有抗氧化性。WYSLAMA的抗氧化性主要是因为W、Y和M的存在及它们在序列中的位置[25]；HMIRL的抗氧化性主要是因为M的存在[26-27]。因此理论上讲，含氨基酸序列为WYSLAMA与HMIRL的肽段数量越多，其抗氧化性应越强。根据Nano-ESI-LC-MS/MS分离鉴定结果，BLGN、BLGW、BLGF和BLG的消化产物中，含氨基酸序列WYSLAMA的肽段种类分别为16、10、22和8，占各自总肽段的9.4%、6.4%、11.6%和5.2%；含氨基酸序列HMIRL的肽段种类分别为10、9、16和11，占各自总肽段的5.9%、5.8%、8.5%和7.1%。由此可以看出，BLG及其不同聚集体的消化产物中均含有具有抗氧化活性的肽段，但聚集方式对其消化产物中具有抗氧化活性的肽段的组成及总数具有明显影响，其中BLGF的消化产物具有较多的抗氧化性肽段。

图6 BLG及其聚集体消化产物中鉴定到的抗氧化肽段的维恩图Fig. 6 Venn diagram of the antioxidant peptides identified in the digestion products of BLG and its aggregates

图6 直观地展示了BLG及其聚集体消化产物中含氨基酸序列为WYSLAMA和HMIRL的肽段的分布情况。根据图6，鉴定到BLG及其聚集体消化产物中含氨基酸序列为WYSLAMA与HMIRL的共有肽段分别有7 种与6 种，这说明这些抗氧化肽段在BLG聚集前后空间结构或所处的微环境没有发生改变，因此酶切位点不变。BLGF中含氨基酸序列为WYSLAMA与HMIRL的独有肽段分别有8 种与9 种，多于BLGN、BLGW和BLG消化产物的独有肽段种类。这说明BLGF的形成有利于产生更多的抗氧化性肽段。

2.5 抗氧化活性分析

蛋白质消化产物是一个混合体，它包含了部分未水解的蛋白、不同分子质量的肽以及不同的氨基酸，而这些组分的抗氧化机制不完全相同。物质的抗氧化性主要包括氧自由基淬灭能力、金属离子螯合能力和还原能力等，因此本实验通过DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率以及总还原能力多个方面综合分析了BLG及其不同聚集体的消化产物的抗氧化活性。

图7 BLG及其聚集体消化产物的抗氧化活性Fig. 7 Antioxidant activity of the digestion products of BLG and its aggregates

DPPH自由基是一种含有机氮的很稳定的自由基，它在517 nm波长处有强烈的光吸收，当加入抗氧化物质时，DPPH自由基的醇溶液颜色变浅导致的吸光度变化与清除自由基能力呈正相关，故可以用来评价作为氢供体或者自由基捕获剂作用的物质的抗氧化能力高低[28]。从图7A中可以看出，BLGN、BLGW、BLGF和BLG的模拟胃液消化产物的DPPH自由基清除率分别为（48.00±5.62）%、（45.91±7.64）%、（51.99±15.33）%和（97.48±5.65）%，其中BLG胃部消化产物的DPPH自由基清除率最高，3 种聚集体的DPPH自由基清除率没有显著性差异。

羟自由基是人体所含的活性最强的一种水溶性自由基，它易与细胞成分和生物分子发生物理化学反应从而对人体造成伤害，因此测定羟自由基清除活性具有重要意义[17]。从图7B中可以看出，经过胃部消化后BLGN、BLGW、BLGF和BLG的羟自由基清除率分别为（8.73±1.23）%、（10.07±0.69）%、（17.74±1.57）%和（19.59±2.35）%，其中水解度较低的BLGF和BLG的羟自由基清除率较高，水解度较高的BLGN和BLGW的羟自由基清除率较低，与杨瑾[29]的报道一致。在该报道中，鸡蛋蛋清蛋白水解度与羟自由基清除率呈负相关。这是因为过高的水解率导致具有抗氧化活性的肽段被水解，从而使得羟自由基清除率较低。

超氧阴离子自由基是人体含量较多的一类亲水性氧中心自由基，它可以作为电子受体形成其他的活性氧自由基[30]。邻苯三酚在碱性条件下自氧化生成超氧阴离子自由基和在320 nm波长处有强烈吸收的有色中间体，在反应初期（5 min左右），有色中间体的积累量与反应时间成正比。当加入抗氧化剂后，阻碍了邻苯三酚的氧化，使其超氧阴离子自由基和有色中间体产生减少，因此抗氧化能力可以通过有色中间体的吸光度来间接测定。根据图7C可知，经过胃部消化后BLGN、BLGF、BLGW和BLG的超氧阴离子自由基清除率分别为（13.29±0.26）%、（14.61±0.20）%、（15.61±0.26）%和（16.11±0.29）%，其中BLGF和BLG的消化产物的超氧阴离子自由基清除率最高，BLGW其次，BLGN最低，也是因为过高的水解率引起抗氧化性肽段水解，进而导致超氧阴离子自由基清除率低。

还原能力是评价抗氧化剂提供电子能力的一个指标，一般认为，物质的还原能力与抗氧化能力呈正相关。本实验的原理是通过测定铁氰化钾中的三价铁被还原成的二价铁在700 nm波长处的吸光度，来反映样品的还原能力，吸光度越高代表还原能力越强，抗氧化能力就越强[18]。根据图7D，经过胃部消化后的还原能力从强到弱依次为BLGF＞BLGN＞BLGW＞BLG，该趋势与含氨基酸序列为WYSLAMA的肽段种类一致，即含氨基酸序列为WYSLAMA肽段种类越多，还原能力越强。由此可见，含氨基酸序列为WYSLAMA的肽段与还原能力呈正相关。

3 结 论

本实验在不同条件下制备了BLG的3 种聚集体，并对BLG及其不同聚集体模拟胃部消化，其消化率从小到大依次为BLGN＞BLGW＞BLGF＞BLG。其原因与其表面疏水性有关。

通过模拟胃液消化BLG及其不同的聚集体，得到不同分子质量的肽段。其中BLGF和BLGN两种聚集体的消化产物中的抗氧化肽段或潜在的抗氧化肽段种类比BLG消化产物多，而BLGF消化产物中最多。BLG消化产物的DPPH自由基清除率最高，3 种聚集体的DPPH自由基清除率没有显著性差异。BLG和BLGF消化产物的羟自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率最高，且没有显著性差异。BLGF消化产物的还原能力最强，BLG消化产物的还原能力最弱，其原因可能与含氨基酸序列为WYSLAMA肽段种类有关，含氨基酸序列为WYSLAMA肽段种类越多，还原能力越强。由此可以得出，BLG消化产物的抗氧化性主要归功于自由基清除能力，BLG聚集体消化产物的抗氧化性主要归功于还原能力。