碳源对凝结芽孢杆菌耐酸特性的影响及其机制研究

李长福，吴影,2,3，周子吕，曹力,3，王大红,2，古绍彬,2,3*

1(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳，471023)2(河南省食品微生物工程技术研究中心，河南 洛阳，471023)3(食品加工与安全国家级实验教学示范中心，河南 洛阳，471023)

凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)是一种能产乳酸的革兰氏阳性菌，生长繁殖迅速，兼具乳酸菌和芽孢杆菌的诸多益生特性[1]。凝结芽孢杆菌芽孢具有的优良抗逆性使其可广泛应用于食品加工中，并能简化益生菌产品的存储运输条件以及延长货架期[2]。益生菌要发挥其益生功能须能经过极端酸环境的胃部到达弱酸环境(pH 4～6)的肠道内进行生长繁殖，并保持足够的活菌数[3]。人体胃液主要成分为胃酸，pH受个人身体状况和饮食习惯影响，其空腹pH值约为2，进食后由于稀释作用可升至3.5[4]。食物进入胃部后停留时间为1～3 h，只有极少部分能够抵抗极端酸环境的微生物才能通过胃部发挥益生作用[5]。绝大多数的微生物因为缺乏耐受低pH环境的相关调节机制，在经胃部酸环境时大量H+进入菌体细胞，引起细胞酸化，进而影响细菌正常生长与代谢，导致菌体死亡。

研究发现，营养组成和培养条件对微生物的耐酸能力有显著影响[6]。菌体细胞在酸性环境下保持胞内pH稳态的一个重要调节途径是细胞膜对H+的低透过性。细菌受到酸环境刺激后细胞膜脂成分会发生相应变化以抵御不良环境造成的影响。吴重德等[7]发现细胞膜中不饱和脂肪酸比例增加以及平均碳链增长会降低细胞膜的流动性，有利于细胞将过多的H+阻挡在胞外，维持胞内pH稳态，从而诱发干酪乳杆菌耐酸能力的变化。陈霞等[8]研究发现H+-ATPase与干酪乳杆菌耐酸性有关，一些阳离子转运ATP酶(如K+-ATP酶)可通过细胞H+和K+的交换，维持细胞内pH的稳定[9]。谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、精氨酸(Arg)、γ-氨基丁酸(GABA)、鸟氨酸(Orn)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)等胞内氨基酸水平发生变化，被认为是微生物耐酸能力变化的主要代谢表征[3, 10-12]。

碳水化合物(碳源)是食物中三大营养成分之一，其进入肠道后也是肠道微生物生长代谢过程中合成细胞碳架及为细胞生命活动提供能量的重要营养物质[13]。不同的碳水化合物及其分解产物，在肠道中与益生菌等肠道微生物接触时，是否影响微生物生长代谢行为及益生特性呢？众所周知，由于基质不同，所诱导微生物产生的代谢酶系也存在显著差异，形成的代谢产物也可能存在较大差异，进而诱发菌体呈现出不同的生理及代谢特征。本研究旨在通过实施胞外碳源扰动实验，分析凝结芽孢杆菌在酸胁迫下生理代谢的响应情况及耐酸能力变化情况，初步揭示碳源变化与菌体耐酸性能间的关系。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

凝结芽孢杆菌(BacilluscoagulansCGMCC 9951)，实验室分离保藏菌株。

液体培养基(g/L)：葡萄糖15，蛋白胨15，酵母粉10，MgSO45，pH 8.0。固体培养基再添加20 g/L的琼脂粉。

不同碳源酸性培养基：以液体培养基为基础将葡萄糖替换为其他相同质量体积比(g∶L)的碳源(蔗糖、乳糖、麦芽糖、柠檬酸、果糖)，用稀盐酸将pH调至pH 3.5。

ATP含量试剂盒、总蛋白定量测试盒(BCA法)：南京建成生物工程研究所；37种脂肪酸混标：上海安谱实验科技股份有限公司；42种游离氨基酸混标：德国曼默博尔公司。

1.2 仪器与设备

7890A型气相色谱仪(配FID氢火焰检测器)，美国安捷伦科技有限公司；A300型全自动氨基酸分析仪，德国曼默博尔公司；UV2100型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 凝结芽孢杆菌CGMCC9951的培养

将冻存于-80 ℃的凝结芽孢杆菌CGMCC 9951接种到培养基中，37 ℃振荡培养16～20 h，活化传代2次，备用。

1.3.2 不同碳源耐酸性能检测

取活化好的菌液，离心洗涤3次后用相同体积生理盐水重悬。按3 %接种量分别接种于不同碳源的酸性培养基中，培养3 h，然后取样采用平板稀释涂布法进行涂布计数。

1.3.3 胞内氨基酸测定

取20 mL活化好的菌液，离心洗涤后加入不同碳源的酸性培养基中培养3 h，然后用磷酸缓冲液离心洗涤(3 000 r/min，4 ℃，5 min)3次，弃上清重悬于1 mL相同缓冲液中。沸水浴15 min，离心(112 40 r/min,4 ℃,10 min)，取上清800 μL，加200 μL 100 g/L磺基水杨酸，混合均匀。4 ℃静置60 min，14 500 r/min冷冻离心15 min，取上清相同操作离心5 min，用样品稀释液等比例稀释后经0.22 μm过滤器过滤后上机分析。氨基酸含量表示为每克细胞(干重)所含氨基酸数，μg/g。

1.3.4 ATP含量测定

根据ATP含量测定试剂盒所提供的试验方法和步骤测定凝结芽孢杆菌酸培养3 h后胞内ATP的含量。ATP含量表示为μmol/g prot。

1.3.5 细胞膜脂肪酸测定前处理

取20 mL活化好的菌体，加入不同碳源酸性培养基中培养3 h，然后用超纯水离心洗涤(10 000 r/min，4 ℃，5 min)3次，弃上清后向沉淀中加入1.5 mL 1 mol/L 甲醇钠振荡1.5 min，4 ℃静置10 min，加入1 mL 正己烷，振荡1 min，静置5 min，取上层有机相过膜后上机测定细胞膜脂肪酸。碳链长度参考文献[7]的方法进行。

1.3.6 气相色谱检测

采用安捷伦7890A型气相色谱仪。色谱柱：HP-88毛细管柱(60 m×0.25 mm，0.20 μm)；升温程序：程序升温至140 ℃保持5 min，以2.5 ℃/min速率升至180 ℃保持3 min，然后1 ℃/min升至196 ℃保持10 min，最后5 ℃/min升至240 ℃保持10 min；载气N2，进样量1 μL。定性采用标准品对照法，定量采用面积归一化法。

1.4 数据处理

图表采用OriginPro 2017软件绘制，数据采用IBM SPSS Statistics 22软件进行统计分析，多重比较采用Duncan新复极差法分析。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对酸胁迫下凝结芽孢杆菌存活的影响

如图1所示，酸胁迫下，添加不同碳源的凝结芽孢杆菌耐酸能力依次是：果糖>葡萄糖>蔗糖>麦芽糖>柠檬酸>乳糖。其中，以果糖作为碳源时，菌体的耐酸能力与对照组相比提高了21%，是蔗糖组的1.69倍，柠檬酸组的27.84倍，乳糖组的35.63倍。杨郁等[6]研究发现，在人工胃液中添加葡萄糖后，干酪乳杆菌T-32的存活率比未添加葡萄糖的对照组提高了118.10倍。郭泽镔[14]研究发现，在pH 2.5酸性处理3 h 的条件下，超高压处理后的莲子淀粉可使双歧杆菌存活率由葡萄糖组的61.31%提高至72.84%。由此可见，碳源种类对菌体的耐酸能力有直接影响。可能由于不同碳源进入细胞后诱导微生物产生的代谢酶系存在显著差异，其在胞内的代谢途径及形成的代谢产物也存在较大差异，引起与酸耐受直接相关的能量代谢水平，细胞膜脂组成，胞内氨基酸代谢等的显著变化，从而使菌体酸耐受能力发生改变。

2.2 不同碳源对酸胁迫下凝结芽孢杆菌胞内ATP含量的影响

碳源为微生物的生命活动提供所需的能量。有报道指出乳酸菌在酸性环境中可利用质子泵F0F1-ATPase消耗能量ATP排出胞内H+，维持胞质pH正常[11]。酸胁迫下，不同碳源对凝结芽孢杆菌胞ATP含量的影响如图2所示，以蔗糖和果糖作为碳源时，胞内ATP含量较高，分别达到了6.925 0 μmol/g prot

图1 不同碳源对酸胁迫下凝结芽孢杆菌存活的影响Fig.1 Effects of different carbon sources on the survivalof Bacillus coagulans under acids tress注：“*”代表差异显著.P<0.05；“**”代表差异极显著，P<0.01。

和5.818 1 μmol/g prot，柠檬酸组ATP含量最低，为0.828 2 μmol/g prot。其中果糖组ATP含量是葡萄糖组1.95倍，是柠檬酸组7.02倍。由于蔗糖水解为葡萄糖和果糖后分别进入葡萄糖代谢途径和果糖代谢途径，果糖代谢不经过糖酵解途径中由磷酸果糖激酶(EC∶2.7.1.11)催化的限速反应步骤，同时1-磷酸果糖是丙酮酸激酶(EC∶2.7.1.40)的激动剂，产生大量的ATP[15]。半乳糖则需经5步反应才能生成葡萄糖-6-磷酸，产生ATP，因此ATP生成速率受到一定影响。尽管柠檬酸是三羧酸循环中的中间物质，但实验结果显示，在所有碳源中柠檬酸所产生的ATP含量最低，主要是高浓度的柠檬酸对菌体产生明显的抑菌作用[16]。KOPONEN等[11]研究发现，在酸胁迫下，乳酸菌F0F1-ATPase酶中F1复合体的全部或部分亚单位表达均上调。KULLEN等[17]证实，pH 3.5的酸胁迫处理嗜热乳杆菌60 min，可使嗜热乳杆菌F0F1-ATPase转录水平提高约2倍。因此，酸胁迫下，高水平的F0F1-ATPase表达量和高浓度的ATP能量水平对维持胞内稳定的pH环境，提高菌体耐酸能力具有重要作用；不同碳源由于其代谢方式不同，产生ATP的含量和速率有一定差异，进而影响菌体对酸胁迫的耐受能力。

图2 不同碳源对酸胁迫下凝结芽孢杆菌胞内ATP含量的影响Fig.2 Effects of different carbon sources on intracellularATP content of Bacillus coagulans under acid stress注：图中不同小写字母代表差异显著，P<0.05。

2.3 不同碳源对酸胁迫下凝结芽孢杆菌膜脂组成的影响

脂肪酸是细胞膜的重要组成成分，脂肪酸的比例以及饱和程度等对细胞膜的流动性和通透性具有显著影响[18]，而细胞膜的流动性和通透性对细胞的新陈代谢和维持细胞稳定的内环境发挥着至关重要的作用。表1为酸胁迫下不同碳源对凝结芽孢杆菌细胞膜脂肪酸组成及百分含量，与正常培养(pH 8.0)的对照组相比，酸胁迫组的脂肪酸组成发生了较大变化，其中以果糖、乳糖等为碳源时，十七烷酸百分含量分别增加至61.87%和61.70%，总饱和脂肪酸(SFA)百分含量分别下降为73.51%和73.67%，总不饱和脂肪酸(UFA)百分含量分别上升至26.49%和26.33%，SFA/UFA比值下降至2.77和2.80，平均碳链长度分别增长至16.18和16.17。BROWN和杨扬等[19-20]发现,十七烷酸含量的显著增加能够提高大肠杆菌耐酸能力及抗高密度二氧化碳(DPCD)胁迫。吴重德等[7]证实酸胁迫干酪乳杆菌45 min后，细胞膜脂碳链长度由15.55增加至16.53。SCHOUG等[21]观察到棒状乳杆菌pH值从5.5降至4.5后，SFA/UFA比值由0.86下降至0.51，可减少由酸胁迫引起的氧应激对细胞产生的损伤[7]。杨旭[22]研究发现，脂肪酸平均碳链长度增长将有助于双歧杆菌提高酸抵抗能力，主要是由于长链更容易跨越磷脂双分子层使膜趋于凝胶状，从而促使细胞膜流动性降低。因此，酸胁迫后细菌凝结芽孢杆菌细胞膜SFA/UFA比值下降及平均碳链长度增长，都导致细胞膜的流动性降低，从而有利于细胞将过多的H+阻挡在胞外，维持胞内pH稳态。

2.4 不同碳源对酸胁迫下凝结芽孢杆菌胞内氨基酸含量的影响

研究发现，胞内较高的Glu、Gln、Arg、Orn等氨基酸水平对提高微生物抵御环境胁迫的能力及调控胞内pH稳定等具有重要作用[23]。酸胁迫下，不同碳源对凝结芽孢杆菌胞内氨基酸水平的影响如表2所示，以果糖为碳源时，与酸耐受性相关的6种氨基酸Glu、Gln、Arg、Orn、Asp和Lys的含量均显著高于其他5组(P<0.05)，分别达到了597.23、44.30、167.16、127.98、178.46和409.05 μg/g。蔗糖组中，上述6种氨基酸含量均显著高于麦芽糖、柠檬酸和乳糖组。而当以乳糖为碳源时，Asp、Arg、Lys含量最低，仅为54.94、69.24和158.75 μg/g。结合图1结果分析，不难发现，不同碳源条件下，菌体耐酸能力与上述氨基酸的胞内水平呈现明显相关性。

表1 不同碳源对酸胁迫下凝结芽孢杆菌膜脂组成的影响Table 1 Effects of different carbon sources on membrane lipid composition of Bacillus coagulans under acid stress

注：C6∶0，己酸；C8∶0，辛酸；C14∶0，肉豆蔻酸；C14∶1，肉豆蔻烯酸；C15∶1，十五碳烯酸；C16∶0，棕榈酸；C16∶1，棕榈油酸；C17∶0，十七烷酸；C18∶0，硬脂酯酸；C18∶1T，反油酸；C18∶1，油酸；SFA，饱和脂肪酸；UFA，不饱和脂肪酸；“-”表示未检出；同行不同字母表示差异显著水平(P<0.05)。下同。

表2 不同碳源对酸胁迫下凝结芽孢杆菌胞内氨基酸含量的影响Table 2 Effects of different carbon sources on intracellular amino acid content of Bacillus coagulans under acid stress

3 结论

研究发现，在酸性环境下，不同碳源可通过影响凝结芽孢杆菌CGMCC9951细胞膜成分及组成比例，增加十七烷酸和总不饱和脂肪酸含量，提高胞内ATP含量，产生更高水平的与耐酸相关氨基酸(如Glu、Arg、Asp、Lys)等方式提高凝结芽孢杆菌耐酸能力。同时还发现，由于果糖代谢可不经过磷酸果糖激酶催化的限速反应，且1-磷酸果糖是丙酮酸激酶的激动剂，从而加速果糖在体内的代谢速率，这对提高菌体的耐酸能力具有重要作用。因此，在使用凝结芽孢杆菌时，辅以果糖或含有果糖的食物可大幅度提高凝结芽孢的酸抵抗能力，这将有利于其进入肠道发挥益生作用。

此外，大量实验研究证实酸胁迫使菌体产生应激蛋白，同时菌体通过质子泵排出H+和产生碱性物质中和胞内过多的H+过程均需要特定酶的参与来完成；有关凝结芽孢杆菌在酸性环境下哪种应激蛋白、伴侣蛋白和产碱酶参与耐酸调控，这都将是本研究在后续工作中持续关注的问题。