酶法转化精氨酸生产胍基丁胺

张言慧，吉武科，高爱存，孙博通，袁建国*

1(山东国力生物技术研究院，山东 济南，250101)2(山东国力生物科技有限公司，山东 济南，250014)

胍基丁胺(agmatine)作为一种重要的生物胺，具有很大的生理功能和医药价值。1994年LI等认为CDS物质便是胍基丁胺[1]，从此对该物质的研究逐渐增多。胍基丁胺由精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase,ADC)催化底物精氨酸脱羧产生[2]。血液中胍基丁胺的质量浓度为0.2～0.4 ng/mL，胍基丁胺在体内几乎分布于所有的器官[3]，在亚细胞水平上，胍基丁胺存在于距内质网和线粒体很近的大密度核心囊泡中[4]。胍基丁胺能抑制细胞内多胺的合成，促进多胺的降解，从而降低细胞内多胺的水平[5]；在中枢神经系统，胍基丁胺可作为一种抗抑郁的药物，减缓耐药性的发生和改善急性吗啡停药综合征[6]；此外，胍基丁胺还能促进记忆的巩固[7]；胍基丁胺能抑制多种细胞的增殖(包括肝癌细胞、血管平滑肌细胞、星型胶质细胞、内皮细胞和肾小管上皮细胞等)[8-9]。在食品、医药等领域国内外需求巨大，市场应用前景广阔。

目前我国胍基丁胺的制备主要来自化学方法，化学法合成胍基丁胺步骤繁琐、效率低、污染重。利用生物法合成胍基丁胺因具有操作简便、反应速率快、无污染等优点，受到了人们的关注。AKASAKA等[10]利用米曲霉固态发酵生产胍基丁胺，产量只有8.3 mmol/L，ZHANG等[11]利用固定化基因重组大肠杆菌催化精氨酸合成胍基丁胺，其产量可以达到20 g/L；SUN等[12]利用基因重组大肠杆菌表达ADC，然后利用该酶催化精氨酸反应，使得胍基丁胺的产量提高到69.22 g/L。本文应用构建的1株基因工程菌发酵表达ADC，通过在摇瓶上对最基本的发酵诱导培养温度、转化pH、辅酶加量及发酵培养基的优化，ADC酶活水平得到提高。15L发酵罐放大实验验证，胍基丁胺产量明显提高。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

含有pET-28a(+)质粒的重组大肠杆菌K12(EscherichiacoliK12,E.coliK12)，为本实验室构建保藏，革兰氏阴性菌。

1.1.2 培养基

种子培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。pH自然，121 ℃高温灭菌20min。

初始发酵培养基(g/L)：甘油10(单消)，蛋白胨12，酵母粉8，Na2HPO4·12H2O 15，K2HPO4·3H2O 10，KH2PO43，柠檬酸2，NH4Cl 1，MgSO40.5，NaCl 0.5，柠檬酸铁铵0.3，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

优化后发酵培养基(g/L)：甘油7(单消)，蛋白胨15，酵母粉5，Na2HPO4·12H2O 18，K2HPO4·3H2O 13，KH2PO45，NaCl 1，MgSO41。pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

1.2 实验方法

1.2.1 检测方法

1.2.1.1 菌体浓度[13]

取一定量的发酵液用纯化水稀释一定的倍数，用UV-1200分光光度计在600 nm下测定其吸光值OD600。取一定体积发酵液离心去上清并烘干至恒重得菌体干重(dry cell weight,DCW)。

1.2.1.2 胍基丁胺

胍基丁胺含量使用岛津LC-20AT高效液相色谱仪测定，色谱柱为Inertsil ODS-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长为210 nm；流动相为0.03 mol/L NaH2PO4，用磷酸调节pH值至3.0；柱温为25 ℃；进样量为20 μL；分析时间为20 min。

1.2.1.3 酶活[14]

酶活检测反应体系组成为：4 mL 0.2 mol/L的KH2PO4缓冲液，200 μLL-Arg母液(125 g/L)，200 μL磷酸吡哆醛(phosphopyridoxal,PLP)母液(4.13 g/L)，200 μL MgSO4母液(25 g/L)。混合后置37 ℃水浴锅中预热15 min，再加入200 μL粗酶悬液反应5 min，离心取上清，检测胍基丁胺浓度计算酶活。

1.2.2 重组菌构建

采用细菌基因组提取试剂盒提取Escherichiacoli的基因组，以其为模板，PCR扩增精氨酸脱羧酶基因。所用脱精氨酸羧基之基因乃adiA非speA[15]，载体pet-28a(+)。所用引物如下：

正向引物F：5′-CGGGATCCCGTACTTTCATAATTAACAAC-3′；反向引物R：5′-CGAGCTCGAATGCGA-AAGTGCGTGTATTG-3′。

PCR反应体系和条件如下：

(1)PCR扩增体系：DNA聚合酶 25 μL；正向引物 2.0 μL；反向引物 2.0 μL；模板DNA 2.0 μL；dd H2O 19 μL。

(2)PCR扩增条件：预变性：95℃，3min；变性：95℃，15s；退火：55℃，15s；延伸：72℃，15 s；循环30次；延伸：72℃，10min；4℃保存。

载体与脱羧基基因所连接处，用BamHI与SacI限制性内切酶处理6 h，用T4DNA连接酶将二者于16℃条件下过夜连接。然后将重组质粒导入感受态E.coliK12细胞中，随之将其涂布于含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板培养基上过夜培养。挑取单菌落，由通用生物进行基因序列的测定以验证其正确性，从而获得正确构建的工程菌株。

1.2.3 摇瓶试验

1.2.3.1 发酵培养与诱导

甘油管保藏菌接种于平板进行活化，37 ℃倒置培养24 h，置4 ℃冰箱保存备用。从平板挑取一环菌苔入摇瓶种子培养基中(50 mL/250 mL锥形瓶)，37 ℃、180 r/min恒温气浴摇床中培养16 h得到种子培养液，以3%接种量接种于发酵培养基中(50 mL/500 mL锥形瓶)，同时添加体积分数为50%的甘油，在37 ℃、180 r/min恒温气浴摇床中培养6 h，再加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG开始诱导，并补加甘油，30 ℃培养16 h后结束发酵。

1.2.3.2 酶转化

转化体系组成为100 g/LL-Arg，8 g/L辅酶PLP，5 g/L MgSO4。转化温度37℃，转化pH 5.0，转化时间：5 h。

1.2.3.3 培养基优化

利用SAS JMP软件对重组菌发酵培养基各成分(A-甘油、B-蛋白胨、C-酵母粉、D-Na2HPO4、E-K2HPO4、F-KH2PO4、G-NaCl、H-NH4Cl、I柠檬酸、J-柠檬酸铁铵、K-MgSO4)进行定制实验设计，实验选取11因素2水平进行。

1.2.4 放大实验

1.2.4.1 发酵

采用上海保兴BIOTECH 15L发酵罐进行补料分批发酵[16]，当罐内底料中碳源与氮源耗尽后，开始流加甘油与氨水，流加速率vC、vN见图1。

图1 甘油与氨水流加曲线Fig.1 The flow curve of glycerol and ammonia

1.2.4.2 酶转化

发酵结束后用50 nm陶瓷膜对发酵液进行浓缩和洗涤，收集菌体浓缩液，并加入L-Arg、PLP及MgSO4，然后加水定容至原发酵液体积，制得转化液，稀H2SO4调节pH至5.0开始反应，反应期间补加L-Arg以提高产物浓度。

2 结果与分析

2.1 ADC发酵诱导温度的选择[17]

为了确定重组E.coliK12发酵的最佳诱导培养温度，本文在摇瓶培养条件下考察了4种不同温度对菌体细胞生长和酶活的影响，实验结果见图2，所用发酵培养基为1.1.2中的初始发酵培养基，IPTG诱导之前的培养方法见1.2.3.1。

图2 不同的诱导培养温度对生物量和酶活的影响Fig.2 The effect of different temperature to the biomass and enzyme activity

由图2可知，不同的诱导培养温度，对菌体生长和ADC的活性大小有一定影响，30 ℃为最适诱导培养温度，此温度有利于酶蛋白形成正确的空间构象，提高了酶活；25 ℃时酶活与OD600值均低，这是因为低温下参与重组蛋白表达的各种酶的活性有所降低，减缓了ADC的表达速率，低温不利于菌体生长，使得产生酶蛋白的数量不足而影响酶活。37 ℃对OD600值影响虽然较小，但对重组蛋白表达速率影响较大，因而酶活较低。

2.2 不同pH条件下ADC对转化效果的影响

转化时pH控制在5个范围(如图3所示)。由于胍基丁胺是精氨酸在ADC催化下脱掉羧基生成的，随着反应的进行，转化体系的pH会随之升高，需要不断调节pH以维持酶的高转化活性。反应结束后检测胍基丁胺与精氨酸浓度计算出酶活与转化率。由图3可以看出pH控制在5.0时胍基丁胺浓度最高，相应的转化率也最高。

图3 不同酸碱性条件对转化效果的影响Fig.3 The effect of acid-base condition to the conversion

2.3 重组菌发酵培养基优化

实验设计及响应值见表1，根据结果筛选出影响ADC活性的显著性因素，得到酶活的预测表达式。从表1中可以看出,在误差允许范围内，酶活实测值与预测值是相符的。

表1 实验设计与结果Table 1 The design of experiment and response values

回归参数及效应检验见表2，在P值为0.1的条件下进行参数分析，结果表明，因素K、I、C、E是显著性影响因子，在实验范围内对ADC的活性影响最大[18]。通过影响因素筛选，得到以ADC活性Y为响应值的回归方程：

该模型的R2=0.997，一般认为，R2至少应该为0.80[19]，说明实测值和预测值之间的相关性很好。在表1高低水平之间，将Y最大化，得到最优培养基(g/L)：甘油7，蛋白胨15，酵母粉5，Na2HPO4·12H2O 18，K2HPO4·3H2O 13，KH2PO45，NaCl 1，MgSO41。

2.4 最优发酵培养基验证

将上述优化培养基与表1中的4号、11号培养基和初始培养基进行对比实验[20]，结果显示最优培养基酶活达到3 552.99 IU，是优化前的2.23倍(图4)。

表2 回归参数及效应检验Table 2 Regression parameter and effect test

图4 不同培养基的酶活水平Fig.4 The enzyme activity of different medium

2.5 PLP浓度对转化产物的影响

选取了6个梯度对辅酶PLP的用量进行优化(见图5)。经过试验将PLP的用量由原来的8 g/L减少至1 g/L，仍可以达到相同的转化效果。当PLP的质量浓度降至1g/L以下时胍基丁胺的浓度明显降低，即辅酶质量浓度为1 g/L时ADC与PLP的结合位点已经饱和，无需再增加辅酶用量。

图5 PLP浓度对转化液中胍基丁胺产量的影响Fig.5 The effect of PLP on the amount of agmatine in conversion liguid

2.6 重组菌发酵与胍基丁胺转化放大实验

发酵过程中随着碳源的消耗会产生大量的CO2及有机酸，这时发酵液的pH值会降低，从而带动了氮源的补入及消耗，维持了菌体生长及目的蛋白表达所需的碳氮比。由图6可知，发酵过程中随着菌体的生长，溶氧逐渐降低，当溶氧降低至20%以下时，体系pH急速下降，重组蛋白表达停止，这是由于菌体产生的大量乙酸产生抑制作用造成[21]。当溶氧稳定在20%的水平时，抑制作用解除，菌体恢复正常。当菌体干重达到5.68 g/L时，将37 ℃培养温度降为30 ℃诱导温度，并加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG进行诱导。

由图6可知，发酵时间5～8 h，μ(比生长速率)开始回升，vX(生长速率)达到整个发酵周期的最大值，表明此时处于对数生长期。至24 h发酵结束时，DCW为33.44 g/L，菌体的vX维持在1 g/(L·h)左右，表明该重组菌具有高密度培养的潜力。

图6 发酵过程菌体生长曲线Fig.6 The curve of bacterial growth during fermentation

经检测最终转化液中胍基丁胺的浓度为279.21 g/L，精氨酸转化率98%(胍基丁胺HPLC检测图谱见图7)。为下一步浓缩结晶工艺奠定了基础。

图7 胍基丁胺HPLC检测图谱Fig.7 The detection chromatogram of agmatine

3 结论

本研究以重组E.coli发酵表达ADC，经过实验，确定了该酶在30 ℃诱导培养优于在其他温度条件下诱导培养表达效果，该酶的最适pH在弱酸性范围内。通过实验设计确定了最优的发酵培养基组成，优化后的发酵培养基ADC活性是优化前的2.23倍。PLP价格较贵，经优化后用量减少数倍，可使生产成本明显降低。发酵与转化放大实验结果表明，最终胍基丁胺质量浓度为279.21 g/L，转化率达到了98%，相较资料报道达到了较高水平。该研究结果对于酶法制备胍基丁胺的产业化具有重要指导作用。