冬凌草甲素/壳聚糖复合膜的性能和结构表征

纠敏，孟媛媛，王倩，汪伦记, 2*

1(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳，471023)2(河南省食品微生物工程技术研究中心，河南 洛阳，471023)

食品包装能够通过保护食品免受外来物理、化学及生物因素的破坏而较长时间维持食品质量和营养价值[1]。随着人们对食品品质和安全的认识和要求日益提高，开发高效绿色、抗菌性强，安全无毒的食品包装已成为当前的研究热点。绿色涂膜基材有多糖和蛋白质类等可食性与聚乙烯醇等非可食性的两大类[2-3]。壳聚糖为甲壳质脱乙酰的产物，由2-乙酰胺基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖通过β-D-(1-4)糖苷键连接而成的线型聚合物，具有良好的生物相容性、可降解性、再生性、抗菌防腐性及成膜性等优点，是一种优质的多糖类涂膜材料[4]。目前，壳聚糖已广泛应用于食品和果蔬包装。但单一壳聚糖膜具有耐水性较差和抑菌谱较窄的缺点[5]，因此，向其中添加天然抑菌剂，如牛至精油、百里香精油和肉桂醛等[6-9]，以改善膜的抗菌性和耐水性满足不同食品的包装需要。冬凌草甲素(Oridonin)是一种从唇形科香茶菜属植物中提取出的贝壳杉烯二萜类天然有机化合物，具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗肿瘤等多种药理活性[10,11]，对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、肺炎双球菌等都有一定的抑制作用[12-14]。作者前期研究结果显示，冬凌草甲素对志贺氏菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、嗜水气单胞菌和单核细胞增生李斯特菌也具有抑菌活性。冬凌草的应用已开发有冬凌草茶和保健牙膏等产品，但目前对其用于食品防腐保鲜的研究鲜有报道。本文对冬凌草甲素/壳聚糖复合膜的物理特性和结构进行表征，并考察了其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑菌效果，以期为冬凌草应用于食品的防腐保鲜提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

冬凌草甲素(纯度98%)，上海源叶生物科技有限公司；壳聚糖(脱乙酰度≥90%)、酵母膏、蛋白胨、琼脂，国药集团化学试剂有限公司；乙酸、甘油、NaCl(分析纯)，天津市德恩化学试剂有限公司；Staphylococcusaureus和Escherichiacoli，中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 培养基

液体培养基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母膏5 g，蒸馏水1 000 mL，用1 mol/L NaOH溶液调节pH 7.2～7.4。121 ℃灭菌20 min备用。固体培养基：液体培养基中添加琼脂20 g/L，121 ℃灭菌20 min备用。

1.1.3 主要仪器设备

紫外可见分光光度计(UV2600)，日本SHIMADZU公司；傅里叶变换中远红外光谱仪(VERTEX 70)，德国BRUCHER仪器公司；波通物性分析仪(TVT-6700)，瑞典PERTEN公司；扫描电镜(TM3030 PLUS)，日本日立高新技术公司；差示扫描量热仪(DSC1)，瑞士METTLER TOLEDO公司；单尖头数显千分尺，东莞市景有模具五金有限公司。

1.2 方法

1.2.1 复合膜液和复合膜的制备

准确称取2 g壳聚糖，溶于100 mL质量浓度为10 g/L乙酸溶液中，在常温下搅拌4～5 h，加入1 mL质量浓度为60 g/L的甘油作为增塑剂，搅拌混合1 h后，加入冬凌草甲素使其终浓度分别为100、75、50、25 μg/mL，搅拌混合30 min，静置过夜超声脱气。取上述制备好的复合膜液10 mL加入直径为9 cm的玻璃培养皿中流延成膜后，于鼓风干燥箱中，35 ℃干燥24 h成膜，按照相同方法制备壳聚糖膜液和壳聚糖膜为对照。

1.2.2 复合膜物理性能的测定

(1)厚度：使用数显千分尺(精度为0.001 mm)测量复合膜厚度，在膜的中心及四角周边随机选择8个点，测厚度后取平均值，单位为mm。

(2)透光率：将复合膜裁剪成4 cm×1 cm的长方形，与比色皿的一侧紧贴，利用紫外可见分光光度计测量膜在600 nm波长处的吸光度[15-16]，每个样品3次平行实验。按公式(1)计算：

透光率/% =10-A600 nm×100

(1)

式中：A600 nm，600 nm波长处的吸光度。

(3)水蒸气透过系数(water vapour permeability，WVP)：在称量杯中加3 g经干燥过的CaCl2，用密封蜡将复合膜覆盖密封称量杯。称量杯在相对湿度为100%的恒湿箱内存放，每隔24 h称取透湿杯的质量，连续3次，每个样重复3次，单位时间称量杯质量的变化为复合膜的水蒸气透过率(WVP)[17]；按公式(2)计算：

(2)

式中：W为透湿杯的增重，g；x为复合膜的厚度，mm；A为膜透水蒸气的面积，/m2；T为2次称量间隔时间，h；Δp为复合膜内外两侧的气压差，取3.168 kPa。

(4)拉伸强度和断裂伸长率：将膜样品裁剪成长150 mm，宽20 mm，使用物性分析仪测定其拉伸强度(tensile strength，TS)和断裂伸长率(elongation at break，EAB)[18]。2个探头的初始夹距80 mm，拉伸速度0.6 mm/s每个样5次平行实验，按公式(3)和(4)计算：

(3)

(4)

式中：F为试样断裂时承受的最大张力，N；L为膜样品的宽度，mm；W为膜样品的厚度，mm；L1为膜拉伸后断裂时的长度，mm；L0为膜样品的长度，mm。

1.2.3 复合膜的结构表征

(1)傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectrometer，FT-IR)分析[19]：将制备的复合膜真空冷冻干燥后，取少量样品与KBr研磨后压片，对复合膜进行傅里叶变换红外光谱分析，扫描范围为500～4 000 cm-1。

(2)扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)分析：将制备的复合膜剪成直径为6 mm的圆片，用扫描电镜观察膜的表面。

(3)热稳定性分析[15]：将制备的膜样品放入35 ℃干燥箱，平衡2 d，称取10 mg左右的膜样品置于坩埚中，从0 ℃加热至150 ℃。升温速率为10 ℃/min，样品室氮气流量为100 mL/min。用差示扫描量热仪(differential scanning calorimetry，DSC)对膜的热稳定性进行测试。

1.2.4 复合膜液抗菌性能的测定

(1)菌种活化和菌悬液制备：挑取1～2环供试菌，接入试管斜面培养基上，37℃培养24 h后，用无菌生理盐水洗下菌苔，制成菌悬液。采用麦氏比浊法，用无菌生理盐水调节细菌含量为1×108CFU/mL。

(2)抗菌性能[20]：在灭菌培养皿中加入10 mL固体培养基，冷却凝固后按一定次序放入数个灭菌的牛津杯。将0.1 mL菌悬液加入到冷却至46 ℃左右的10 mL固体培养基中，混匀后倒入灭菌平板，冷却后用无菌镊子取出牛津杯。分别加入100 μL冬凌草甲素质量浓度分别为100、75、50、25 μg/mL的复合膜液和壳聚糖膜液，37 ℃培养24 h，测量抑菌圈的直径。每个样3次平行实验。

1.3 统计分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。实验数据以x±SD的形式表示。组间分析采用One-Way ANOVA两两比较得到相应的P值，P<0.05和P<0.01为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 冬凌草甲素对复合膜厚度、透光率和水蒸气透过系数的影响

冬凌草甲素对复合膜的厚度、透光率和水蒸气透过系数的影响见表1。由表1可知，壳聚糖中加入冬凌草甲素，复合膜的厚度基本没有变化；透光率则随着冬凌草甲素含量的增加而下降，但差异不显著。

水蒸气透过系数是膜的重要指标之一，是影响食品损失率和水分迁移的重要因素。对复合膜的水蒸气透过系数测定结果显示，冬凌草甲素能改善复合膜的阻湿性，显著降低复合膜的水蒸气透过系数(P<0.05)。这是由于冬凌草甲素是疏水性的物质，其亲水性能较弱，当加入壳聚糖中时，可降低水分子通过复合膜的吸附和扩散速率。但复合膜的水蒸气透过系数随着冬凌草甲素的浓度增加，其下降的趋势不显著。这与SNCHEZ-GONZLEZ等[21]报道的疏水性化合物由于其疏水性而增强了聚合物基膜的水阻隔性能，降低了膜的水蒸气透过能力的结果一致。

表1 冬凌草甲素对复合膜厚度、透光率与水蒸气透过系数的影响Table 1 Effect of Oridonin on thickness, light transmittance and water vapor permeability of the composite films

注：同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 冬凌草甲素对复合膜机械性能的影响

冬凌草甲素对复合膜机械性能的影响见表2。由表2可知，随着冬凌草甲素添加量的增加，复合膜的拉伸强度与断裂伸长率逐渐下降。与壳聚糖膜相比，冬凌草甲素质量浓度为50、75和100 μg/mL时，复合膜拉伸强度分别降低了6.91%、10.80%和16.00%，断裂伸长率分别降低了10.50%、12.98%和20.95%，差异显著(P<0.05)。复合膜抗拉强度和断裂伸长率的降低可能是由于冬凌草甲素与壳聚糖分子间的相互作用影响了壳聚糖分子骨架间的内聚力，改变了复合膜中壳聚糖分子的网状结构；同时由于添加冬凌草甲素使膜的疏水基增加，导致应力减少，使得复合膜的机械性能降低[22]。

表2 冬凌草甲素对复合膜机械性能的影响Table 2 Effect of Oridonin on the mechanical properties of the composite films

2.3 复合膜的傅里叶变换红外光谱分析

a为壳聚糖膜；b～e分别为含冬凌草甲素质量浓度为25、50、75和100 μg/mL的复合膜图1 复合膜的红外光谱图Fig.1 FT-IR spectra of the composite films

2.4 复合膜的扫描电镜图

复合膜的扫描电镜图见图2。由图2-a可知，壳聚糖膜的表面光滑，平整。当冬凌草甲素添加量为25 μg/mL时，其能较均匀地分散于壳聚糖膜中，复合膜表面比较光滑平整，没有出现团聚现象，不存在裂缝和小孔。随着冬凌草甲素添加量的继续增加，复合膜表面变得越来越粗糙(图2-b～图2-e)，说明冬凌草甲素与壳聚糖的相容性随着其含量的增加而降低，导致其在膜中分布不均匀，出现团聚现象，致使界面受力不均匀，降低复合膜的机械性能。

a为壳聚糖膜；b～e分别为含冬凌草甲素质量浓度为25、50、75和100 μg/mL的复合膜图2 复合膜的扫描电镜图(1 000×)Fig.2 The SEM photographs of the composite films

2.5 复合膜的热稳定性分析

冬凌草甲素对复合膜的热稳定性的影响见图3。由图3可知，冬凌草甲素能提高复合膜的热变性温度。壳聚糖膜的热变性温度为95.14 ℃，冬凌草甲素与壳聚糖共混后制备的复合膜热变性温度均高于单一壳聚糖膜，当冬凌草甲素质量浓度为50 μg/mL时，复合膜的热变性温度最高达到118.43 ℃，说明冬凌草甲素和壳聚糖具有较好的相容性，两者共混后形成了较为牢固的结构，提高了复合膜的热稳定性。

a为壳聚糖膜；b～e分别为含冬凌草甲素质量浓度为25、50、75和100 μg/mL的复合膜图3 复合膜热稳定性曲线图Fig.3 DSC curves of the composite films

2.6 复合膜液的抑菌性能

复合膜液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌作用见图4。由图4可知，冬凌草甲素能提高复合膜液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性，并随着冬凌草甲素质量浓度的增加而增加。壳聚糖膜液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为(11.02±0.020)mm和(13.04±0.010)mm，而冬凌草甲素质量浓度为50 μg/mL的复合膜液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为(14.12±0.012)mm和(14.86±0.012)mm，抑菌活性分别提高了28.13%和12.57%，差异显著(P<0.05)。研究表明，壳聚糖的正电荷能与微生物细胞膜表面的负电荷相互作用，通过改变细胞膜的通透性而起到杀菌作用[24]。冬凌草甲素可通过破坏细胞膜的通透性,抑制菌体的呼吸代谢和蛋白质的合成等途径杀菌[25]。这可能由于冬凌草甲素和壳聚糖不同的杀菌机制，当两者共混成膜后，复合膜的抑菌活性得到增强。

a为壳聚糖膜；b～e分别为含冬凌草甲素质量浓度为25、50、75和100 μg/mL的复合膜图4 复合膜液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of the complex film liquids on E.coli and S. aureus

3 结论

随着冬凌草甲素含量的增加，复合膜的厚度基本没有变化，透光率、拉伸强度和断裂伸长率逐渐下降，水蒸气透过系数显著降低(P<0.05)，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性明显增强。对复合膜微观结构的研究显示,冬凌草甲素与壳聚糖的功能基团形成了氢键，有较好的相容性，有利于冬凌草甲素在壳聚糖膜中分散均匀，形成表面较光滑的复合膜表面。冬凌草甲素质量浓度为50 μg/mL的复合膜的各项性能指标良好，热稳定性最好，其复合膜液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性分别提高了28.13%和12.57%，具有实际应用价值。