苯磺酸左旋氨氯地平片微生物限度检查及方法验证

张聪聪，程龙，毛腾霄

技术与方法

苯磺酸左旋氨氯地平片微生物限度检查及方法验证

张聪聪，程龙，毛腾霄

610046 成都市食品药品检验研究院

苯磺酸左旋氨氯地平为二氢吡啶类长效钙离子拮抗剂，主要用于治疗高血压和心绞痛，因其疗效显著、作用持久、副作用低，在临床得到广泛应用[1]。微生物限度作为质量控制的指标之一，应在生产过程中进行监测并对最终产品进行检查[2]。之前有文献按照《中国药典》2010 年版要求，对其进行微生物限度方法验证，并报道该药物具有一定的抑菌性[3]。而《中国药典》2015 年版[4]与 2010 年版相比，在方法验证中所使用的菌株与判断标准都有所变化，且目前尚未有相关的文献报道。故本试验按照《中国药典》2015 年版四部非无菌药品微生物限度标准规定，对苯磺酸左旋氨氯地平片进行微生物限度检查及方法验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 苯磺酸左旋氨氯地平片由四川省百草生物药业有限公司提供，规格：5 mg，批号：Y171201、Y180101、Y180102。

1.1.2 仪器 BHC-1000ΙΙA/B3 生物安全柜购自苏净集团安泰公司；DK-600S 型三用恒温水箱购自上海精宏试验设备有限公司；LRH-250 生化培养箱、GHP-9270 隔水式恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；HVA-110 高压灭菌锅购自日本 Hirayama 公司；YT-X30 微生物限度检测仪购自杭州盈天科学仪器有限公司。

1.1.3 培养基 胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、蛋白胨均由北京三药科技开发公司生产，按标签说明进行配制。

1.1.4 菌种 金黄色葡萄球菌（）[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌（）[CMCC(B)631001]、铜绿假单胞菌（）[CMCC(B)10104]、大肠埃希菌（）[CMCC(B)44102]、白色念珠菌（）[CMCC(F)98001]、黑曲霉（）[CMCC(F)98003]均来源于中国食品药品检定研究院，均为第 4 代培养物。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备 按照《中国药典》四部制备金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的 50 ~ 100 CFU/ml 的菌悬液，进行活菌计数备用。

1.2.2 供试液制备[5]分别取本品 10 g（批号：Y171201、Y180101、Y180102），加 pH 7.0 的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至 100 ml，匀浆仪混匀得 1:10 供试液。

1.2.3 需氧菌总数计数方法验证试验

1.2.3.1 常规法 ①试验组：取上述 5 种试验菌悬液0.1 ml，分别加到 10 ml 的 1:10 供试液中，混匀，取 1 ml 注入平皿，每株试验菌平行制备 2 个平皿，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，凝固后倒置培养，置 33 ℃培养 5 d计数；②菌液对照组：取 5 种试验菌悬液 0.1 ml，分别加至10 ml pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，取 1 ml 的试验菌液注入平皿，同试验组操作；③供试品对照组：取 1:10 供试液 1 ml 注入平皿中，同试验组操作。试验组回收率=（试验组菌落数– 供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数。

1.2.3.2 稀释法 取 1.2.2 项下的 1:10 供试液 1 ml，加 pH 7.0 的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至 10 ml，混匀得 1:100 供试液。将除黑曲霉外的 4 种菌悬液 0.1 ml，加至 10 ml 的 1:100 供试液中，混匀，取 1 ml 注入平皿，平行制备2 个平皿，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，测定菌落数，计算回收率。

1.2.3.3 薄膜过滤法 取 1.2.2 项下的 1:10 供试液1 ml，用 300 ml 无菌 pH 7.0 的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗，在最后一次冲洗时分别加入 1 ml 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液。取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基上，测定菌落数，计算回收率。菌液对照组、供试品对照组、稀释剂对照组同法操作。稀释剂对照组回收率 = 稀释剂对照组菌落数/菌液对照组菌落数。

1.2.4 霉菌和酵母菌总数计数方法验证试验

1.2.4.1 常规法 试验组、菌液对照组、供试品对照组操作同 1.2.3.1，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，置 24 ℃培养7 d 计数。

1.2.5 控制菌检查方法验证试验

1.2.5.1 大肠埃希菌 取 1.2.2 项下 1:10 供试液 10 ml 和 50 ~ 100 CFU 试验菌加入到 100 ml 胰酪大豆胨液体培养基中，根据相应控制菌检查法检出，应检出试验菌。

2 结果

2.1 需氧菌总数计数方法的确定

常规法、稀释法、薄膜过滤法试验结果分别见表 1 ~ 3。三个批号样品三次独立试验中，采用常规法检查，仅黑曲霉的回收率在 0.5 ~ 2 范围内；采用稀释法检查，抑菌性仍不能完全消除，除黑曲霉外，仅白色念珠菌的回收率在 0.5 ~ 2 范围内，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌回收率均小于 0.5，可见本品对细菌有较强的抑菌作用；采用薄膜过滤法检查，以上三种细菌的回收率均达到 0.5 ~ 2 之间。故样品的需氧菌总数计数可采用薄膜过滤法进行检查。

2.2 霉菌和酵母菌总数计数方法的确定

采用常规法检查，结果如表 4 所示，白色念珠菌和黑曲霉的回收率均在 0.5 ~ 2 之间，故本方法适用于检测样品中霉菌和酵母菌总数。

表 1 常规法验证试验需氧菌总数回收率

表 2 稀释法验证需氧菌总数试验回收率

表 3 薄膜过滤法验证需氧菌总数试验回收率

表 4 常规法验证试验霉菌和酵母菌总数回收率

表 5 大肠埃希菌检查方法（胰酪大豆胨液体培养基：100 ml）验证结果

2.3 大肠埃希菌检查方法的确定

结果如表 5 所示，试验组和阳性对照组均有检出，阴性对照组和供试品对照组均未检出，故样品中的大肠埃希菌可采用常规法检查。

3 讨论

已有研究表明，钙拮抗剂苯磺酸氨氯地平可拮抗胞外的 Ca2+内流，调控铜绿假单胞菌（PA）的[Ca2+]i，从而抑制 PA 的群体感应，抑制毒力因子如蛋白水解酶和弹性蛋白酶的表达，可明显降低绿脓毒素的表达[6]。通过对药品微生物限度检查所使用的方法进行验证，检测药品含有的微生物含量及控制菌的量。采用准确的微生物限度检查方法，能提高抑菌性药品微生物检测结果的准确性和可靠性[7]，从而为药品生产、检验及监管提供必要的理论依据。经验证，对苯磺酸左旋氨氯地平片分别采用薄膜过滤法、常规法进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数，采用常规法进行控制菌检查，可以消除其抑菌活性，符合《中国药典》2015 版的标准规定。

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张聪聪，Email：zhangcongcong1117@163.com

2019-04-08

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.013