SV2A基因真核表达质粒构建及其在HEK293T细胞中的表达*

张晓敏，王培昌，刘 静

(首都医科大学宣武医院检验科，北京 100053)

突触神经递质释放功能障碍与各种中枢神经系统疾病的发病机制密切相关，突触的数量改变也与许多脑部疾病有关[1-2]，如阿尔茨海默病、癫痫等疾病[3-4]。突触囊泡蛋白2A(SV2A)是一种膜蛋白，特异性表达于突触囊泡中，主要调节脑内动作电位依赖性神经递质释放。研究发现，SV2A与癫痫的发病机制及治疗存在密切联系，SV2A基因敲除小鼠出生后不久即表现出严重的癫痫发作[5]。据报道，不同类型的癫痫动物和癫痫患者脑内SV2A蛋白表达水平均有不同程度的改变，以SV2A为治疗靶点的抗癫痫药物左乙拉西坦及其类似物目前已被广泛应用于临床[6-8]。然而SV2A调控癫痫的作用机制仍未可知，为了进一步研究SV2A基因在癫痫等神经系统疾病中的功能，本文构建了鼠SV2A基因的真核表达质粒，并在HEK293T细胞中进行了表达与鉴定，旨在为进一步研究SV2A在神经系统疾病中的机制及作用提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 真核表达载体p3×Flag-CMV-10和HEK293T细胞均为中科院生物物理研究所惠赠；菌株Top10感受态细胞、DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、T4 DNA连接酶、500 bp DNA ladder和D15000+2000 DNA ladder购自中国北京Tiangen公司；HindⅢ、EcoRⅠ限制性内切酶、CutSmart购自美国NEB公司；5×All-In-One RT Master Mix购自加拿大Abm公司；Trizol、Lipo3000购自美国Invitrogen公司；DMEM培养基、胎牛血清、双抗购自美国Gibco公司；BCA蛋白水平测定试剂盒、5×Tris-甘氨酸蛋白电泳缓冲液、10×电转液、5×蛋白上样缓冲液购自中国北京Solarbio公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司；抗Flag抗体购自美国Sigma公司；抗β-actin抗体及对应二抗购自中国北京中杉金桥公司；PCR仪购自美国ABI公司；高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；电泳仪购自美国Bio-Rad公司；曝光仪购自中国上海天能科技有限公司。

1.2方法

1.2.1获得cDNA 用Trizol法提取APP/PS1双转基因小鼠海马组织RNA[9]，用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA：以RNA为模板，加入5×All-In-One RT Master Mix。PCR程序为：25 ℃ 10 min；42 ℃ 15 min；85 ℃ 5 min；冷却至4 ℃，即获得模板cDNA。

1.2.2获得目的基因 依据GenBank数据库中鼠SV2A(基因ID:64051)基因mRNA的序列(NM_022030.3)，设计巢式PCR引物，应用Primer-Blast设计第1对引物，引物序列为F1:5′-TCC AGG CCC TAG TTC CTC TC-3′，R1:5′-TGT GCC TGC CAT CCC TAA AG-3′。根据基因编码区序列设计第2对引物，分别在上下游引物中加入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，并加入相应的保护碱基，引物序列为：F2:5′-CCC AAG CTT ATG GAA GAA GGC TTT CGA GAC -3′，R2:5′-GGA ATT CTC ACT GCA GCA CCT GTC C-3′。引物由中国生工生物工程技术服务有限公司合成。以cDNA为模板，分别以F1、R1和F2、R2为引物，进行两轮PCR扩增，条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃ 10 min；冷却至4 ℃。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分离并在紫外灯下切胶回收目的条带，回收、纯化扩增产物采用Tiangen的DNA回收试剂盒。

1.2.3重组质粒的构建 用限制性内切酶HindⅢ和EcoRⅠ分别对载体p3XFlag-CMV-10和SV2A的基因扩增产物进行双酶切，酶切体系50 μL。酶切载体时：载体10 μL，10×Cut Smart 5 μL，两种内切酶各1 μL，体系用ddH2O补齐。酶切目的基因时：DNA产物43 μL，10×Cut Smart 5 μL，两种内切酶各1 μL。目的基因扩增产物37 ℃孵育2 h，载体孵育时间延长至4～6 h。将全部酶切产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，并对目的条带切割回收。将回收的目的基因与载体以3∶1的比例混合，加入T4 DNA连接酶和T4 DNA Buffer，室温连接1 h。将连接产物转化至感受态大肠杆菌Top10中，37 ℃ 200 r/min摇菌45 min，将转化后的菌液接种于加有氨苄青霉素的LB固体培养基，37 ℃孵箱过夜培养。挑取多个单克隆菌落，分别置于10 mL加入氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃ 200 r/min摇菌12～14 h，用Tiangen质粒小提试剂盒提取质粒。

1.2.4重组质粒的鉴定 用HindⅢ和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切，对产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，根据酶切片段大小鉴定重组质粒是否构建成功。同时对双酶切鉴定构建成功的重组质粒送中国上海生工生物工程技术服务有限公司进行基因测序，将测序结果与GenBank中的SV2A的cDNA序列进行比对。

1.2.5重组质粒的表达 在六孔板中培养HEK293T细胞，DMEM培养基中含有10%胎牛血清和1%双抗(青霉素、链霉素)，置于37 ℃，CO2水平为5%的恒温培养箱中培养。当细胞生长状态良好，融合度达到70%～90%时，进行瞬时转染。配制转染试剂A：125 μL DMEM培养基与5 μL Lipofectamine 3000混合孵育10 min。配制转染试剂B：125 μL DMEM培养基中加入5 μL P3000和2.5 μg p3×Flag-CMV-10-SV2A质粒或空载体质粒(作为空白对照)。将试剂A与试剂B混合后在室温下孵育10 min，再加入六孔板的培养基中混匀继续培养，8 h后换成新鲜配制的完全培养基，37 ℃培养至48 h时收集细胞，加入1%Triton×100裂解蛋白。

1.2.6蛋白质印迹法(Western blot)鉴定 将提取的总蛋白用BCA法测定蛋白水平[10]，各取40 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到PVDF膜上(350 mA，2 h)。转膜结束后裁膜，用TBST缓冲液洗膜3次，每次5 min，然后用5%的脱脂奶粉持续封闭2 h，加入特异性的Flag抗体(1∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜；用TBST缓冲液洗膜，每次5 min，共3次；加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠的二抗(1∶10 000)，室温孵育1 h，再用TBST缓冲液洗膜3次，每次5 min。加入电化学发光液后曝光。以β-actin作为内参。

2 结 果

2.1SV2A全序列经PCR扩增后电泳鉴定 SV2A基因经PCR扩增后对产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，利用紫外凝胶电泳成像系统分析，对照DNA Marker，在2 239 bp左右可见1条清晰条带，与预期目的条带大小一致，见图1。

注：M表示蛋白标准带；1表示SV2A基因扩增条带；2表示空白对照。

图1SV2A基因扩增产物

2.2重组质粒p3×Flag-CMV-10-SV2A的酶切鉴定及测序 重组质粒p3×Flag-CMV-10-SV2A经HindⅢ和EcoRⅠ酶切后进行1%的琼脂糖凝胶电泳，经凝胶电泳成像系统分析，可见位于2 239 bp处的SV2A目的基因片段和6 200 bp左右处的p3×Flag-CMV-10载体片段，说明SV2A基因已成功插入p3×Flag-CMV-10载体中，且阳性菌落测序后与GenBank检索的SV2A的cDNA序列进行比对，结果证明SV2A正确插入p3×Flag-CMV-10载体，见图2、3。

注：M表示蛋白标准带；1表示转染重组质粒条带；2表示空白对照。

图2p3×Flag-CMV-10-SV2A的酶切鉴定

图3 SV2A测序结果

2.3Western blot分析SV2A蛋白在HEK293T细胞的表达 质粒转染48 h后收集细胞，裂解后提取蛋白，Western blot结果显示转染p3×Flag-CMV-10-SV2A质粒的HEK293T细胞在82×103左右处可见1条明显条带，与预期结果相符，转染空载体p3×Flag-CMV-10的HEK293T细胞及空白对照组细胞未见SV2A蛋白表达，见图4。

注：M表示DNA标准带；1表示重组质粒扩增条带；2表示转染空载体条带；3表示空白对照。

图4SV2A在HEK293T细胞中的蛋白表达

3 讨 论

SV2A是突触囊泡蛋白2的家族成员之一，该蛋白家族还包括SV2B和SV2C，这3种同源基因均表达于神经元和内分泌细胞的囊泡中。其中SV2A是分布最广泛的一种亚型，主要分布于脑组织中，包括大脑皮层、海马和小脑等部位。它能够调节动作电位依赖的神经递质的释放，维持突触囊泡稳态，并参与内分泌囊泡的胞吐作用[11-12]。人类SV2A基因位于1号染色体长臂的2区1带(1q21.2)，包含14 565个碱基对，编码了一段有13个外显子的约4 353个碱基对的mRNA，翻译成相对分子质量约为82.6×103的蛋白，共包含742个氨基酸[13]。SV2A有一段长而保守的N-末端序列，其中前57个氨基酸是与突触结合蛋白-1(SYT-1)C2B结构域相互作用的部位，SYT-1是一种Ca2+感受器，二者结合可以调节突触的胞吐作用。SV2A共有12个跨膜结构域，其中第6、7跨膜结构域之间有1个凸向胞质内的大环结构，第7、8跨膜结构域之间有1个凸向囊泡腔内的大环结构，后者有3个N-糖基化位点，这3个位点对于神经肉毒素BoNT/A和BoNT/E进入神经元至关重要[14-15]。

本实验过程中利用巢式PCR技术扩增目的基因，巢式PCR需要设计2对引物，通过第1对引物扩增出的产物比目的DNA片段长，第2对引物又称巢式引物，因其扩增的目的片段位于第1对PCR扩增产物的内部而得名，非目的片段与两套引物同时结合的可能性很小，因此通过该引物可特异性的扩增出位于首轮PCR产物内部的DNA片段。质粒构建过程中载体的选择至关重要，p3×Flag-CMV-10是一种常用的带有3×Flag标签的真核表达载体，它具有许多优势可保证基因稳定高效的表达，普通的Flag标签含8个氨基酸残基，而3×Flag标签含22个氨基酸残基，位于融合蛋白的外表面，具有很高的免疫灵敏度，便于检测和纯化目的蛋白；功能强大的CMV启动子能够驱动目的蛋白高水平表达；多克隆位点便于目的基因插入；具有多种限制性酶切位点可供选择；内有Neo抗性标记，可用G418筛选成功转染了重组质粒的细胞；既可用于瞬转也可用于稳转。上述独特的结构优势可保证目的基因在哺乳动物细胞内稳定高效表达且便于检测。HEK293T细胞来源于人胚胎肾上皮细胞，是一种常用的研究外源基因表达的细胞株，细胞增殖速度快，贴壁生长，但其贴壁强度较低，因此换液时应格外小心。易于转染和稳定表达的特性使其成为一种强大的研究基因功能的工具细胞而被广泛应用。本实验也选用了HEK293T细胞作为验证基因表达效果的细胞，结果表明，转染效果理想，重组质粒p3×Flag-CMV-10-SV2A成功转染HEK293T细胞，且目的蛋白得到稳定正确表达。本结果为进一步研究SV2A在癫痫等神经系统疾病中的功能奠定了实验基础。

4 结 论

本实验利用分子克隆的方法成功构建了重组真核表达质粒p3×Flag-CMV-10-SV2A，通过菌落PCR、酶切和测序检测了质粒构建的正确性，并在HEK293T细胞中验证了其表达情况。p3×Flag-CMV-10-SV2A真核表达质粒的构建为今后建立稳定表达SV2A的细胞模型，为进一步研究SV2A的生物学功能及其在神经系统疾病中的作用奠定了实验基础。