细胞程序性死亡-配体1基因启动子区rs10815225多态性与结直肠癌的关联研究

马晓骉，张 麒，潘定国

(云南省肿瘤医院：1.生物治疗中心；2.腹部外科；3.结直肠外科，云南昆明 650118)

免疫疗法是当前最具前景的肿瘤治疗方法之一。细胞程序性死亡-受体1(PD-1)/细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)是肿瘤免疫治疗的一个重要靶点，两者结合可抑制抗肿瘤免疫应答[1-2]。PD-L1在人类多种肿瘤，包括结直肠癌中呈高表达，与淋巴结转移和预后等临床特征密切相关，影响细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移[3-10]。有研究显示，PD-L1基因启动子区rs10815225不同等位基因与转录因子SP1的结合不同，导致不同个体对胃癌的易感性不同[11]。鉴于rs10815225是一个功能性多态位点，推测该位点多态性可能与结直肠癌的风险有关。本研究运用病例-对照研究调查rs10815225多态性与中国汉族人群结直肠癌的关联，并分析其对转录活性和PD-L1 mRNA的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 血液样本：收集2012年3月至2017年5月在本院住院的结直肠癌患者215例作为病例组，同期收集本院体检健康者236例作为对照组。两组研究对象均来自云南地区，均为汉族个体，相互间无亲缘关系，性别和年龄差异无统计学意义(P>0.05)；病例组中饮酒和吸烟个体均高于对照(P≤0.05)。结直肠癌纳入标准：(1)经医院病理科确诊；(2)未经放、化疗治疗者。结直肠癌排除标准：(1)结直肠癌术后复发者；(2)非原发性结直肠癌者；(3)有家族史者。215例病例中，高、中分化158例，低分化57例；临床Ⅰ～Ⅱ期108例，临床Ⅲ～Ⅳ期107例。采集外周静脉血2～3 mL，乙二胺四乙酸抗凝，-20 ℃冰箱保存备用。组织样本：手术切除结直肠癌组织样本65例，离体样本经液氮速冻，-80 ℃冰箱保存备用，所有样本均经医院病理科确诊。本研究经医院伦理委员会批准。见表1。

表1 病例组和对照组临床资料

1.2试剂与仪器 引物由中国擎科生物科技有限公司合成；基因组DNA提取试剂盒、DNA分子量标准、聚合酶链反应混合物、Trizol试剂、TIANScript Ⅱ反转录试剂盒和SYBR Green荧光定量PCR试剂盒均购自中国北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ购自美国NEB公司；pGL3载体和定点突变试剂盒购自美国Promega公司；荧光定量PCR仪购自德国Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1DNA抽提及rs10815225多态性分析 基因组DNA通过试剂盒法抽提。直接测序法分型rs10815225。测序引物序列如下：上游5′-CGA AGG TCA GGA AAG TCC AA-3′，下游5′-AGG AAC AAC GCT CCC TAC CT-3′。PCR总反应体系50 μL，其中2×PCR缓冲液25 μL，上、下游引物各2 μL，基因组DNA 2.5 μL和去离子水18.5 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。PCR反应产物送中国擎科生物科技有限公司测序。

1.3.2实时荧光定量PCR检测PD-L1 mRNA表达 Trizol法提取结直肠癌组织总RNA，按照反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒说明书操作进行PD-L1 mRNA相对水平分析。PD-L1引物：上游5′-GGT GGT GCC GAC TAC AA-3′，下游5′-TAG CCC TCA GCC TGA CAT-3′。内参基因选用甘油醛-3-磷酸脱氢酶，上游引物：5′-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3′，下游引物：5′-GGG GTC ATT GAT GGC AAC AAT A-3′。PCR反应总体系10 μL，含2×SYBR Green 5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL和去离子水2 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30s，60 ℃ 35 s，40个循环。记录目的基因和内参基因的循环阈值(Ct)，采用2-ΔCt法计算不同rs10815225基因型结直肠癌患者中PD-L1 mRNA的相对表达量。

1.3.3双荧光素酶活性检测 参考文献[11]构建pGL3-rs10815225G和pGL3-rs10815225C重组载体。以rs10815225GG纯合子DNA为模板扩增PD-L1启动子区，上游引物：5′-GGC TAG GGT ACC CGT TCA GAT GTT GGC TTG TTG-3′，下游引物：5′-GGC TAG CTC GAG GGA AGC TGC GCA GAA CTG GGG-3′。经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切，连接pGL3载体，构建pGL3-rs10815225G重组载体。运用定点突变试剂盒将G突变为C，突变引物：5′-GAC CCC GCC TCC CGG CCT GGC GCA AC-3′。提取质粒，获得pGL3-rs10815225C重组载体。高糖DMEM培养基培养结直肠癌细胞HCT116，接种于24孔板，Lipo2000转染pGL3、pGL3-rs10815225G和pGL3-rs10815225C载体，pRL共转染，48 h后检测荧光素酶活性。

2 结 果

2.1HWE检验 入选病例组和对照组研究个体PD-L1基因启动子区rs10815225基因型分布符合HWE定律，P>0.05。

2.2PD-L1基因启动子区rs10815225多态性与结直肠癌的相关性 对照组中，PD-L1基因启动子区rs10815225GG和CG基因型频率分别为80.5%和19.5%；疾病组中，频率分别为89.3%和10.7%。Logistic回归结果显示，调整性别、年龄、饮酒和吸烟因素后，与GG基因型相比，CG基因型降低结直肠癌患病风险(OR=0.48，95%CI0.28～0.83，P=0.01)。对rs10815225基因型频率按照分化程度和TNM分期进行分层分析，Logistic回归结果显示，rs10815225多态性与以上临床特征无相关性(P>0.05)。见表2。

表2 PD-L1基因启动子区rs10815225多态性与结直肠癌的相关性

2.3rs10815225多态性对荧光素酶活性和PD-L1 mRNA的影响 结直肠癌HCT-116细胞转染空质粒pGL3、pGL3-rs10815225G和pGL3-rs10815225C，48h后检测双荧光素酶活性。与空质粒pGL-3相比，转染pGL3-rs10815225G和pGL3-rs10815225C后荧光素酶活性均明显增加。与pGL3-rs10815225G相比，转染pGL3-rs10815225C后荧光素酶活性明显降低(P<0.05)。PD-L1 mRNA在rs10815225GG基因型结直肠癌患者中的相对表达量为0.64，在rs10815225CG基因型患者中的相对表达量为0.06。两组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1B。

注：A表示结直肠癌HCT-116细胞转染空质粒pGL3、pGL3-rs10815225G和pGL3-rs10815225C48 h后，荧光素酶活性，*P<0.05；B表示rs10815225GG和CG基因型结直肠癌患者中PD-L1 mRNA的表达差异，*P<0.05。

图1rs10815225多态性对荧光素酶活性和PD-L1mRNA的影响

3 讨 论

PD1/PD-L1，作为重要的免疫检查点，在肿瘤免疫治疗中的作用备受瞩目[12-16]。PD1表达于多种免疫细胞，例如细胞毒性T淋巴细胞、B细胞和单核细胞等。PD-L1作为PD1的配体，传递细胞信号抑制T细胞活化和增殖，介导自身免疫耐受。多种肿瘤细胞表面表达PD-L1，与PD1结合，抑制细胞毒性T淋巴细胞的杀伤作用及细胞因子的释放，从而导致肿瘤细胞发生免疫逃逸[3-7]。基于PD-L1在肿瘤免疫中的重要作用，该基因上的遗传变异可能成为肿瘤发生和预后的一个生物学标记物。

最近，TAO等[11]报道了位于PD-L1基因转录起始位点上游62 bp的一个功能性多态位点rs10815225C/G，G等位基因可与转录因子SP1结合，而C等位基因则不能，造成携带CG基因型胃癌患者中PD-L1 mRNA表达明显降低，进而降低胃癌的发病风险。随后，有研究报道该多态性与PD-L1蛋白表达和胃癌的预后无关[17]。由于遗传多态性与结直肠癌的发病有关，例如脂联素基因rs2241766位点、环氧化酶-2基因-765G/C位点、HIPPO通路RASSF1A基因rs2236947位点、白细胞介素17Ars10484879位点、髓过氧化物酶基因启动子区rs2333227位点和miR-17-92启动子区rs9588884和rs982873位点等[18]。因此，推测PD-L1基因多态性可能影响结直肠癌的易感性个体差异。本研究回顾性调查了rs10815225在215例结直肠癌和236例对照组中的分布，发现CG基因型携带者结直肠癌的发病风险降低50%，提示可能是结直肠癌的保护因素之一。以往全基因组关联研究证实，9p24是结直肠癌的1个易感位点[19]，PD-L1基因恰好位于该易感区域(9p24.1)，由此认为本研究结果具有一定的理论研究支持，合理可靠。

为了探讨rs10815225CG基因型降低结直肠癌风险的可能机制，本研究运用双荧光素酶报告基因检测系统和实时荧光定量分析了rs10815225对基因转录活性和PD-L1 mRNA的影响，发现与rs10815225G等位基因相比，rs10815225C等位基因对应的细胞转录活性显著降低，导致PD-L1 mRNA表达下调，结直肠癌的发病风险降低。该研究结果与TAO等[11]在胃癌中观察到的结果一致，证实了由于rs10815225C等位基因不能与转录因子SP1结合，致使转录活性下降，具有促癌作用的PD-L1 mRNA水平降低，最终导致结直肠癌的罹患风险减小。

本研究亦存在一定的局限性，临床样本采集时未考虑一些混杂因素，比如体质指数、饮食习惯(油炸烟熏及腌制食品)、吸烟是否被动等，因此无法校正更多的混杂因素，基因—环境相互作用值得进一步深入研究。

4 结 论

PD-L1基因启动子区rs10815225CG基因型通过降低基因转录活性和PD-L1 mRNA表达，进而降低中国汉族人群结直肠癌的发病风险，提示rs10815225可能作为结直肠癌新的免疫治疗靶点。