microRNA-671-5p在肝细胞癌中的表达及其负向调控丝切蛋白2与上皮细胞-间质转化的关系

李亚昭，姚博文，石磊

（西安交通大学第一附属医院 1.转化医学中心 2.肝胆外科，陕西 西安 710061）

肝细胞癌（HCC）是目前世界范围内公认的第三大恶性肿瘤，且具有极高的致死率，预后情况极不乐观[1-3]。目前HCC 的诊断治疗方法已经逐渐完善，但是对其发生发展的机制研究仍是国际研究热点。通过对侵袭转移的分子机制的研究，或有望对HCC 的早期诊断及治疗产生指导作用。microRNA（miRNA）的发现开创了新一代了解肝细胞癌致癌作用的研究方向。miRNA 是一种小的非编码RNA，能够通过切割靶信使RNA 或抑制靶基因翻译的方式来抑制靶基因的表达[4-6]。许多microRNA（如：miR-149、miR-107、miR-608）[7-9]都已经成为HCC 中相关发病机制的研究靶点。

近年来，HCC 相关的miRNA 研究仍为热点，机制研究表明：miRNA 既能够在肿瘤中发挥促癌作用（包括促进瘤体增殖、侵袭播散及肺转移）又可发挥抑癌作用（包括促进凋亡、抑制细胞增殖，抑制细胞迁移）。目前已有研究报道显示，miR-671-5p 能够介导胃癌、胶质瘤、黑色素瘤等恶性肿瘤的发生发展，同时与手足口病病毒、EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBv）感染及乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）介导的肝损伤相关[10-15]，但其与HCC 之间的具体关系目前仍未见报道。因此，本研究的核心在于分析在HCC 发生时miR-671-5p 表达水平的变化，并探究其与HCC 临床病理学特征的相关性，进而探究miR-671-5p 对HCC生物学行为的影响，并初步探索其下游潜在靶点及分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和器材

细胞培养基DMEM 购自Gibco 公司；Mir-X™ miRNA First-Strand Synthesis Kit 购自TaKaRa 公司；青、链霉素购自美国sigma 公司；Matrigel基质胶购自美国BD 公司；胎牛血清购自Gibco公司；miR-671-5p 模拟物和模拟物对照序列、miR-671-5p 抑制物和抑制物对照序列均购自上海GenePhama 公司，miR-671-5p模拟物（5'-AGG AAG CCC UGG AGG GGC UGG AG-3'），miR-671-5p 抑制物（5'-CUC CAG CCC CUC CAG GGC UUC CU-3'）；FastStart Universal SYBR Green Master 购自罗氏公司；miR-671-5p 及U6 引物序列购于吉凯基因；所用抗体E-cadherin（14472S）、N-cadherin（13116S）、vimentin（5741S） 均 购自CST 公司；CFL2（ab96678）购自abcam 公司；β-actin（sc-47778）购自Santa 公司；CCK-8 试剂盒购自日本同仁；CFL2 所用小干扰RNA 购自百奥迈科公司；双荧光素酶报告试剂盒购自Promega；lipo2000 购自赛默飞公司；细胞培养相关耗材均购自美国Corning 公司。

1.2 标本收集

相关临床肝脏组织标本，均来源于2011年 1月—2013年12月期间在本院行根治性切除术的HCC 患者，且所有样品均经术后病理诊断确诊为HCC。临床标本共计80 例（男51 例，女29 例）；年龄分布为35～72 岁，平均年龄为49.8 岁，且在手术之前均未接受任何非手术相关治疗。所涉及的每例患者都具有完整病例资料和病理诊断。术中采集癌组织与癌旁组织（距肿瘤边缘＞1 cm）后，将组织标本迅速液氮冷冻后，转入-80 ℃保存。本研究已取得所有相关患者知情同意及西安交通大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养及转染 人HCC 细胞系Hep3B、HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H 以及人正常肝细胞L02 均在上海复旦大学中山医院肝癌研究所进行购买。将添加过双抗（100 U/mL 青霉素与100 g/mL 链霉素）以及10% 胎牛血清的DMEM 细胞培养液用于细胞培养。将细胞培养皿置于恒温密闭培养箱（37 ℃、5% CO2）内进行培养。于转染前24 h 胰酶消化并计数后接种于6 孔板。每孔细胞数为1.5×105个，使细胞密度达到60%。按照Lipofectamine 2000 说明书在6 孔板接种的肿瘤细胞中，使用miR-671-5p 模拟物/ 抑制物及其对照进行转染，且每孔转染量均为30 pmol。通过使用转染小干扰RNA 采用相同方式对CFL2 进行低表达，每孔小干扰RNA 的转染量为10 μL。

1.3.2 RNA 提取及qRT-PCR 检测 使用TRIzol Reagent 提取组织和细胞中的总RNA，并按照说明书进行逆转录，然后应用FastStart Universal SYBR Green Master 操作说明进行qRT-PCR 检测。检测miRNA 表达时以U6 作为内参，检测mRNA表达量时以β-actin 作为内参，利用SPSS 19.0 软件进行基于2-ΔΔct法的数据统计分析。

1.3.3 CCK-8细胞活力检测实验 对数期生长细胞，分别转染miR-671-5p 抑制物及抑制物对照序列后，进行细胞计数并调整其浓度至1×104个/mL 后，向96 孔板内每孔加入100 μL（1×103个/ 孔），每孔设置5 个复孔，5% CO2，37 ℃培养贴壁后，分别于0、24、48、72 h 向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，继续培养 0.5 h。将酶联免疫检测仪设置为采集OD450 nm 处的吸光值，使用空白对照调零后，进行实验孔的吸光值采集，并重复3 次。

1.3.4 Transwell 小室实验 将经过处理的细胞消化并重悬，调整其细胞悬液浓度为1～2×105个/mL 后，向每个小室中加入100 μL 细胞悬液（其中用于侵袭实验的小室已提前进行Matrigel 胶孵育包被），向小室外的孔中加入500 μL 的完全培养基。细胞培养箱中培养12 h 后，将小室在无菌的超净工作台中取出，95% 乙醇溶液固定15 min，使用0.1% 结晶紫染色10 min 后，使用PBS 溶液洗去浮色并自然风干。将小室放置于载玻片上并使用倒置显微镜拍摄后计数（100 倍下随机选取6 个视野，并重复3 次）。

1.3.5 Western blot 按照RIPA（强）试剂盒说明书提取组织及细胞内的蛋白，经BCA 蛋白定量后。用SDS-PAGE 试剂盒配制10% 分离胶后进行上样（每孔总蛋白量为50 μg），使用湿转转膜仪将蛋白转印至PVDF 膜上。50 g/L 脱脂牛奶封闭 4 h，加PBS 稀释的CFL2 一抗（1:500）、E-cadherin一抗（1:400）、N-cadherin 一抗、vimentin 一抗及β-actin 一抗（1:2000），抗体孵育盒置于4 ℃冰箱孵育14 h；TBST 洗膜4 次且总时长为30 min，加HRP 标记的二抗（抗兔或抗小鼠，稀释比为 1:10000），室温孵育3 h；二抗孵育结束后，继续TBST 洗膜4 次且总时长为30 min 后，使用超敏ECL发光试剂盒显影并进行灰度扫描后的半定量分析。

1.3.6 双荧光素酶实验 PCR 扩增丝切蛋白2（CFL2）-3'UTR-WT（野生型）和CFL2-3'UTRMUT（突变型）序列，将扩增后的序列分别转入重组质粒中；构建好的重组质粒分别与miR-671-5p 模拟物共同转染Hep3B 细胞，48 h 后收集细胞，严格按照说明书操作实验。最后通过发光化学仪检测萤火虫及海肾荧光表达量数值的比值。

1.3.7 生物信息学分析 从TCGA 数据库（https://cancergenome.nih.gov）下载HCC 患者的基因表达数据，分析miR-671-5p 在HCC 组织与癌旁组织的表达差异，以及miR-671-5p 表达状态与预测所得靶基因表达的相关性。利用TargetScan（www.targetscan.org） 与Starbase（https://www.starbasegame.com）分析miR-671-5p 的结合位点。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0 软件包分析数据，数据以均数± 标准差（±s）表示，采用t 检验，P＜0.05 有统计学意义。

2 结 果

2.1 miRNA-671-5p 在HCC 及癌旁组织中的表达

80 对临床样本中，HCC 组织中miR-671-5p的相对表达量为2.5310±0.0349，癌旁组织为0.3848±0.0248，差异有统计学意义（P＜0.001）（图1A）。进一步检测不同肿瘤的TNM 分期的组织中miR-671-5p 的相对表达量，其中早期（1～2 期） 的病例数为62 例，中晚期（3～4 期）病例数为 18 例，两组的相对miRNA 表达量差异有统计学意义（P＜0.05）（图1B）。

图1 qRT-PCR 检测miR-671-5p 表达 Figure1 The expressions miR-671-5p detected by qRT-PCR

经生物信息软件对TCGA 大样本数据库同步预测分析，发现数据库中所提供的miR-671-5p 表达量情况也为HCC 组织的表达量明显高于正常组织（P＜0.001）（图2）。

图2 TCGA 数据库中miR-671-5p 在HCC 及正常组织中的表达水平Figure2 The expression levels of miR-671-5p in HCC tissues and tumor adjacent tissues in TCGA database

2.2 miR-671-5p 与HCC 临床病理因素的关系

以80 例HCC 的miR-671-5p 平均表达值（1.995）为标准，将miRNA-671-5p 的含量分为高表达组和低表达组，其中高表达组42 例，低表达组38 例。经分析结果显示，miR-671-5p 的表达水平与AFP 水平、肿瘤数目、静脉侵犯、Edmondson-Steiner 分级及TNM 分期明显有关（均P＜0.05），而与性别、年龄、HBV 等指标无关（均P＞0.05）（表1）。

2.3 miR-671-5p 在HCC 细胞系中的表达情况

通 过qRT-PCR 检 测HCC 细 胞 系Hep3B、MHCC-97H、HepG2、SMMC-7721 和人正常肝细胞L02 中miR-671-5p 的表达水平。实验结果显示，与L02 细胞比较，miR-671-5p 在HCC 细胞系中的表达均明显升高，其中高转移性的MHCC-97H 细胞系中miR-671-5p 升高最为明显（均P＜0.05），因此选择在MHCC-97H 细胞系中敲低miR-671-5p 进行后续试验（图3）。

2.4 转染效率检测及miR-671-5p 的表达对HCC细胞增殖的影响

为了明确miR-671-5p 对细胞增殖的影响，使用miR-671-5p 抑制物敲低MHCC-97H 内的miR-671-5p 的表达量，通过qRT-PCR 实验检测其敲低效率，结果显示，敲低后miR-671-5p 的表达明显降低（P＜0.01）（图4）。在不同时间点，利用CCK-8 法检测OD450 nm 处经转染miR-671-5p 抑制物或后抑制物对照序列的MHCC-97H 细胞的增殖能力。结果显示，经48 h 转染的miR-671-5p 抑制物的MHCC-97H 细胞增殖能力与对照组相比明显下降（P＜0.01）（图5）。

表1 miR-671-5p 与HCC 临床病理特征之间的关系[n（%）]Table1 Relations of miR-671-5p expression with clinicopathologic characteristics of HCC [n (%)]

图3 miR-671-5p 在HCC 细胞系与正常肝细胞系中的表达Figure3 The expressions of miR-671-5p in HCC cell lines and normal hepatic cell line

图4 转染效率检测Figure4 Determination of the transfection efficiency

图5 CCK-8 检测miR-671-5p 对HCC 细胞增殖的影响Figure5 The influence of miR-671-5p on cell proliferation in HCC cells by CCK-8 assay

2.5 miR-671-5p 的表达对HCC 细胞侵袭与迁移的影响

为进一步探究miR-671-5p 在HCC 细胞侵袭与迁移中的具体作用与功能，利用瞬转miR-671-5p 抑制物的方式将MHCC-97H 细胞中的miR-671-5p 低表达后进行Transwell 实验。发现低表达miR-671-5p 后MHCC-97H 细胞系的侵袭与迁移能力均发生明显降低（均P＜0.01）（图6）。

图6 Transwell 小室检测miR-671-5p 对HCC 细胞迁移及侵袭能力的影响（×100）Figure6 Transwell assay to assess the effect of miR-671-5p on migration and invasion in HCC cells (×100)

2.6 miR-671-5p 靶基因分析及其表达情况

经TargetScan 及Starbase 分析发现，CFL2与miR-671-5p 存在碱基互补配对，CFL2 为miR-671-5p 的潜在靶基因（图7A）。目前已有报道称，CFL2 在多种肿瘤内中表达降低，并存在抑制上皮细胞- 间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）发生的功能。从而抑制HCC 的侵袭及迁移，为明确miR-671-5p 与CFL2 的关系，通过使用miR-671-5p 抑制物下调MHCC-97H细胞系中miR-671-5p 的表达后，经qRT-PCR 检测CFL2 表达量，结果显示CFL2 的表达量明显升高（P＜0.001）（图7B），并且在MHCC-97H 细胞系中CFL2 的表达量与miR-671-5p 的表达量呈明显负相关（P＜0.01）（图7C）。经TCGA 数据库分析，证实CFL2 在HCC 中表达量明显降低（P＜0.01），且与miR-671-5p 的表达量呈明显负相关（P＜0.01）（图7D-E）。

图7 靶基因分析及验证 Figure7 Analysis and verification of the target gene

2.7 miR-671-5p 表达水平对CFL2 的表达的影响极其与EMT 的关系

为进一步明确miR-671-5p 对CFL2 的调控作用，通过突变miR-671-5p 与CFL2 的结合位点后，进行双荧光素酶实验检测。结果显示当结合位点被突变后，高表达miR-671-5p 无法再引起CFL2 的mRNA 水平的变化，从而证实了miR-671-5p 与CFL2 之间的相互结合（图8A-B）。通过qRT-PCR 验证CFL2 siRNA 的敲除效率，发现CFL2 siRNA1 敲除效果最好（图8C），因此使用siRNA1 对CFL2 的表达进行敲低。经Western blot 检测发现，低表达miR-671-5p 后CFL2 蛋白表达水平明显升高，同时抑制了EMT 相关蛋白的表达。当在低表达miR-671-5p 的基础上同时敲低CFL2，检测发现CFL2 的表达量降低且部分抵消了miR-671-5p 对EMT 相关指标蛋白表达的抑制作用（图8D-E）。因此，在细胞水平间接证明了CFL2 为miR-671-5p 的潜在靶点，而miR-671-5p 可通过抑制CFL2 的表达促进HCC 细胞EMT 的发生。

图8 miR-671-5p 对CFL2 的调控及其对EMT 的影响 Figure8 Regulation of miR-671-5p on CFL2 and their influence on EMT

3 讨 论

目前HCC 的诊断治疗方法已经逐渐完善，HCC 分子机制研究中涉及miRNA、lncRNA、外泌体、循环RNA 等诸多分子，已成为近年研究的热 点领域[16-23]，例如miR-149、miR-122、miR-107、miR-608、miR-221[7-9,24-26]发现在HCC 的致癌作用中发挥的作用调节目标基因。目前现有研究结果显示miR-671-5p 与胶质瘤、胃癌、黑色素瘤等恶性肿瘤的发生发展具有紧密的联系，同时与手足口病、EB 病毒感染及HBV 介导的肝损伤相关[10-15,19]，但其与HCC 的发生发展之间的关系目前仍未见报道。

本实验通过qRT-PCR 检测了来源于本院的共计80 对HCC 患者组织样品及与之对应的癌旁组织中miR-671-5p 的表达；应用统计学方法分析miR-671-5p 的表达水平与HCC 临床病理特征的相关性；通过qRT-PCR 法检测HCC 细胞系中miR-671-5p 的表达水平，并应用Transwell 分析miR-671-5p 对HCC 相关细胞系的侵袭与迁移能力的影响。发现miR-671-5p 在HCC 组织中表达显著升高，并通过网络数据库资源筛选分析发现，高表达的miR-671-5p 与肿瘤数目、Edmondson-Steiner 分级、静脉侵犯、AFP 水平、病理分级及TNM 分期显著相关。综上所述，miR-671-5p 应为HCC 中的促癌基因。

为探讨miR-671-5p 在HCC 中的具体作用及其分子机制，本研究检测了HCC 细胞系（MHCC-97H、Hep3B、HepG2、SMMC-7721）及正常肝细胞L02 中miR-671-5p 的表达水平。结果显示，HCC 相关的各种细胞系中miR-671-5p 表达都呈现升高的状态，与之前结果相符。

HCC 发生发展过程中，最为重要和常见的生物学行为就是侵袭与转移，其中EMT 的发生则是侵袭中最为重要的环节[27-28]。关于miR-671-5p 的多项研究已经表明，miR-671-5p 与肿瘤的恶性增殖、侵袭和转移具有显著的相关。本研究中，使用miR-671-5p inhibitor 下调了HCC 细胞系中miR-671-5p 的表达水平，通过Transwell 实验进一步探究miR-671-5p 与HCC 侵袭与迁移能力之间的关系，所得到的结果为低表达miR-671-5p 能够显著抑制HCC 相关细胞系的侵袭和转移。目前也有报道称miR-671-5p 能够通过抑制URGCP 的表达，进而促进胃癌细胞凋亡，从而发挥抑癌作用[12]。同时，miR-671-5p 也可以抑制乳腺癌细胞EMT 的发生[13]，但其具体分子机制均不明晰。因此，后续的分子机制研究，则需要进一步验证其可能潜在的调节机制，从而确定可能的未来的治疗靶点。

CFL2 是目前肿瘤相关的热点靶基因，是一种细胞骨架蛋白能够介导细胞骨架重塑。与多种恶性肿瘤相关，通过抑制CFL2 从而抑制肿瘤的侵袭迁移及EMT 的发生[27,29-32]。经TargetScan 及Starbase 分析发现，CFL2 为miR-671-5p 的可能靶基因。经过Western blot 发现低表达miR-671-5p 后，CFL2 蛋白显著高表达，EMT 的指标下调。同时回复实验结果显示，EMT 指标能够被显著逆转。因此能够间接证明CFL2 可能为miR-671-5p的潜在靶点。

综上，miR-671-5p 在HCC 组织标本及HCC细胞系中高表达，与其恶性程度显著相关。miR-671-5p 能够促进HCC 细胞系的增殖、侵袭及迁移，并通过抑制CFL2 的表达来促进EMT 的发生。此项研究或许能够为HCC 后续的精准诊疗工作提供潜在靶点与相关理论依据。