两种非手术方法建立犬骨关节炎动物模型的对比研究

王朝强 李雪丽 何晓宇 李惠梅 吴李勇 周之平 王 春

福建医科大学附属闽东医院，福建福安 355000

膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是常见的退行性疾病之一。随着社会人口老龄化，发病率逐年增高，严重危害人类的健康，同时也对社会经济造成极大的负担[1]。有研究显示，中国有症状的KOA的患病率为8.1%[2]。骨关节炎是以关节软骨退行性改变为核心，累及软骨下骨，包括滑膜、关节及其他结构改变的慢性炎症[3-4]。骨关节炎动物模型是研究骨关节炎发病机制、危险因素及其治疗方法的重要手段[5]。目前还缺乏既符合人类关节炎的病理发展特点，又可以为临床诊断治疗提供有力证据的动物模型[5-7]。本研究采用关节腔内Ⅱ型胶原酶注射法及关节制动法建立犬KOA动物模型，可作为研究膝关节骨关节炎的理想动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Beagle犬12只（普通级），均2岁左右，9雌3雄，购于福州振和实验动物技术开发有限公司[许可证编号：SCXK（闽）2012-0001]，比格犬膝关节均无明显异常，精神状态良好。本研究符合福建医科大学附属闽东医院对研究的相关伦理要求[批件号：[2019]宁闽医伦理审字第（0916-0）号]。

1.1.2 实验设备及试剂 GE3.0T 750MR机、柯达750DR机、孝感亚光包埋机、显微照相机等。高分子石膏，Ⅱ型胶原酶（美仑生物），Ⅳ型胶原蛋白免疫组化试剂盒（武汉博士德）等。

1.2 实验动物分组

比格犬12只，随机分为药物组（Ⅱ型胶原酶关节腔内注射法）和石膏组（关节制动法），药物组犬于关节腔内分别注射4mg/mL的Ⅱ型胶原酶0.1mL，石膏组的实验犬于关节过伸位固定[6-10]。

1.3 检测方法及病理学检测

在实验前及实验后1、3、6、12周分别行关节正侧位X线片、MRI检查。影像学检查方法：实验犬麻醉后仰卧于检查床，沙袋固定、伸直双侧下肢，行正侧位照片，同法进行膝关节MRI扫描。并于实验后3、12周将实验犬分批手术，切取关节内软骨及软骨下骨组织，行病理学检查。病理学检查方法：实验犬麻醉后切开膝关节腔，手术切取部分滑膜组织，再分别于负重部位切取软骨面至软骨下骨柱状标本，制备成5μm厚的石蜡切片，分别行HE染色、阿利新蓝染色、Masson染色及Ⅳ型胶原蛋白免疫组化检测，光学显微镜下观察。

1.4 观察指标

观察的指标包括膝关节X线片、MRI检查结果、组织病理学检查等，并以改良Mankin评分标准对关节软骨的病理改变作量化分析[11-12]。

1.5 统计学方法

应用SPSS15.0统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以（）表示，采用配对样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 犬膝关节X线

在造模前后比较中，石膏组造模后X线片见关节间隙稍变窄、模糊，髁间嵴稍变尖，见唇状骨质增生，髌骨间隙略变窄，药物组造模后X线片检查主要表现为关节间隙变窄。见图1、2。

图1 石膏组X线图像（1a 固定前、1b 固定后3周、1c 固定后12周）

图2 药物组X线影像（2a 药物注射前、2b 药物注射后3周、2c 注射后12周）

2.2 犬膝关节MRI检查

在实验终点犬膝关节MRI检查中，石膏组显示膝关节积液，量较大，关节软骨表面不规则，缺失的最大深度超过50%，部分出现软骨剥脱，病理分级达到Ⅲ级以上。药物组提示关节积液，相对于石膏组积液量较少，关节软骨表面不规则，缺失的最大深度在50%左右，病理分级也达到Ⅱ级以上。见图3 ～ 5。

2.3 犬膝关节病理学检查

两组病理学检查均出现膝关节炎特征性的病理学改变。早期见关节软骨基质变薄，细胞老化、凋亡，药物组早期病理改变较为明显，后出现软骨细胞排列紊乱，潮线上移，然后软骨表面裂隙、剥脱，细胞成簇生长、甚至出现细胞减少，潮线模糊消失。两组HE染色均可见染色变深，胶原纤维、细胞老化。Masson染色中见胶原纤维染色变深老化，炎症浸润。阿利新蓝染色中可见到关节软骨基质中染色明显变浅，表面其粘多糖含量减少，在石膏组后期尤为明显。在Ⅳ型胶原蛋白免疫组化中见斑片状或团块状染色，提示软骨内血管生长并穿入软骨层。最终石膏组病理分级根据改良Makin评分以中重度为主，药物组以轻中度为主。见图6～9。

图3 术前MRI图像

图4 石膏组12周MRI影像

图5 药物组12周MRI影像

2.3.1 Masson染色

图6 正常、药物组及石膏组犬膝关节组织Masson染色结果（×40、×100、×200、×400）

2.3.2 HE染色

图7 正常、药物组及石膏组犬膝关节组织HE染色结果（×40、×100、×200、×400）

2.3.3 阿利新蓝染色

图8 正常、药物组及石膏组犬膝关节组织阿利新蓝染色结果（×40、×100、×200、×400）

2.3.4 Ⅳ型胶原蛋白免疫组化

图9 正常、药物组及石膏组犬膝关节组织Ⅳ型胶原蛋白免疫组化结果（×40、×100、×200、×400）

表1 两组犬骨关节炎动物模型的改良Makin评分

2.4 两组犬骨关节炎动物模型的改良Makin评分

随着时间的延长，石膏组的病理改变在实验3周较轻，后逐渐加重，至12周时发展为中重度膝关节炎。药物组膝关节炎病理改变主要发生在3周，随着时间的延长，关节炎并未显著加重。见表1。

3 讨论

KOA发病率高，对生活影响较大。膝关节炎的动物模型制备方法主要分为手术方法及非手术方法[5，13]。对关节炎的检验评估方法也较多[14]。本研究采用的Ⅱ型胶原酶注射法及石膏固定法均操作简单，应用多种方法进行综合评估。Ⅱ型胶原酶注射法能够在短期内造模成功，需要时间较短，一般3周左右即可，延长造模时间对于该动物模型意义不大，主要表现为早中期骨关节炎改变。石膏法造模所需时间较长，约12周左右，随着时间的延长，骨关节炎的程度逐渐加重。在造模的不同阶段可以显示不同时期的骨关节炎改变，在病理学改变上更加符合骨关节炎的病理学特征。

X线片检查是骨关节炎诊断的金标准，但缺乏敏感性[15]。常用于骨关节炎动物模型的评估[16]。因X线片对于软骨组织显示的欠缺，仅对关节间隙及周围增生骨赘情况的进行评估。本研究中犬膝关节X线片检查不能准确反映关节炎的情况，在病理显示为骨关节炎晚期的模型中，其X线仍不典型。因此，X线片可作为诊断标准之一，但尚不足作为一个评判标准。在动物模型的评估中MRI检查更准确，敏感性高。它不仅显示关节软骨，对于半月板、韧带、关节滑膜等组织均可以清晰显示，在骨关节炎不同时期均有典型表现[17-18]。将滑膜增厚、软骨变薄、侵蚀、软骨下骨病变、关节积液等情况直观的显示出来。在本研究中，造模12周后药物组多处于骨关节炎早中期，而石膏组多处于中晚期。在MRI图像上对于早期滑膜的病变、关节积液、关节软骨下病变均有清晰的显示，而在中晚期可以见软骨变薄、软骨下骨囊性变等特征性改变。与段鑫等[19]的研究结果相符。且相对于手术造模方法，本研究所示的骨关节炎表现更加符合人退行性骨关节炎的特征。病理学检查作为大多数疾病诊断的“金标准”，在骨关节炎动物模型中得到广泛的应用[20]。病理学检查可以从细胞层面把软骨细胞、胶原纤维、黏多糖、潮线、血管长入等改变清楚的呈现出来[21-24]，且对于骨关节炎病理学分级分期更灵敏、有效。在本研究的病理学检查中出现软骨细胞减少、排列紊乱、成簇生长；胶原纤维染色不均匀且染色变淡；黏多糖减少，尤其是在中重度骨关节炎中；潮线的上移、模糊不清、甚至消失；团块状的血管长入等，以上这些都是在骨关节炎不同时期的典型表现。

KOA的发病目前认为与软骨及软骨下骨的损伤密切相关[4，25-28]。在本研究中MRI及病理学检查均发现软骨及其周围的病变。各期关节炎的典型表现均可见到。有研究表明关节炎的发生与血管长入及血管翳形成有关，而本研究在对血管基质的Ⅳ型胶原蛋白染色中也得到了证实[21]。

综上所述，Ⅱ型胶原酶注射法及石膏固定法均可成功制备犬KOA动物模型。在非手术方法中较为简便实用，各有优劣，在造模的不同时间段可以表现出不同程度的典型病理形态。为KOA的发病机制及诊疗研究提供了良好的实验条件，奠定了研究基础。