液相色谱法测定蔬菜中3种氨基甲酸酯类农药残留量的不确定性评价

刘顺字 韩文节 欧志鹏 华四妹 郭淑贞 廖远东 林双娣

摘要：采用液相色谱法检测蔬菜中残留的3种氨基甲酸酯类农药，对方法中的主要不确定度来源进行量化，计算总不确定度和扩展不确定度。结果表明，液相色谱法检测3种氨基甲酸酯类农药的相对标准不确定度分量（Urel）均表现出Urel标准品（总）>Urel回收率>Urel样品>Urel仪器的规律。研究结果为检测蔬菜中的氨基甲酸酯类农药残留提供了参考。

关键词：液相色谱法;氨基甲酸酯类农药;蔬菜;不确定度

中图分类号：S482.3+4文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）06-1569-06

Abstract：Liquid chromatography method was applied to detect the residues of three carbamate pesticides in vegetables， the sources of main uncertainties were quantified， and the total uncertainty and expanded uncertainty were calculated. The results showed that the relative standard uncertainty components （Urel） of three carbamate pesticides all presented the rule of UrelStandard sample（total）>UrelRecovery rate>UrelSample>UrelInstrument. The results provide a references for analyzing the residues of carbamate pesticides in vegetables.

Key words：liquid chromatography method;carbamate pesticides;vegetable;uncertainty

在检测蔬菜中的农药残留时，实验室采用的检测方法会直接影响检验、检测报告的质量，因此在实验室初次选用标准或非标准方法开展检测时，通常需要对选定的方法进行确认[1]。在使用非标准方法或某些标准方法进行检测时，还需要进行不确定度的评估[2]，通过评估不确定度可以量化主要不确定因子与检测结果的范围[3]。由此可见，评价测量的不确定度是保障实验室检测结果质量的重要手段之一[4]。

液相色谱仪在市（县）级农产品检测机构中的应用较为广泛，主要用于测定蔬菜、水果中氨基甲酸酯类农药的残留情况，是农产品检测机构使用的重要检测仪器之一[5-6]。本研究通过评定不确定度的基本方法，分析不确定度分量的因素与其对检测结果的影响程度[7-8]，以期为正确评价和使用测量结果提供试验依据。

1材料与方法

1.1试验材料

本试验所用材料为四九菜心，购自中振智农科技有限公司。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器液相色谱仪（LC-20A， RF-20Axs），产自日本Shimadzu公司;匀浆机（T18DS25），产自德国IKA公司;高速离心机（TDL-5-A），产自上海安亭科學仪器厂;氮吹仪（N-EVAP-112），产自美国Organomation公司;万分之一电子分析天平（JJ-124BC），产自常熟市双杰测试仪器厂;1 000 ml砂芯过滤装置，产自天津市津腾实验设备有限公司。

1.2.2试剂灭多威、甲萘威、克百威标样均由原农业部环境保护科研监测所提供，质量浓度均为100μg/ml，溶剂均为甲醇。乙腈（99.99%）、甲醇（99.99%）与二氯甲烷（99.9%）均为色谱纯，产自Honeywell;NaOH为优级纯，产自广州化学试剂厂;硼酸为优级纯，产自广州化学试剂厂;99%邻苯二甲醛，产自PICKERING;巯基乙醇，产自株式会社同仁化学研究所;SPE-NH2固相萃取小柱，产自Shimadzu。除试验用水为超纯水外，其他试验试剂均为分析纯。

1.3试验方法

1.3.1提取与净化用200 ml烧杯称取25.000 0 g解冻的菜心鲜样，再向烧杯中倒入50.0 ml乙腈，用匀浆机在烧杯中高速匀浆2 min后，将混合物倒入三角漏斗中进行过滤，滤液用装有6.0 g氯化钠的具塞量筒全部收集。过滤后，双手剧烈摇晃具塞量筒1 min，然后将其静置30 min，取上清液10.0 ml转移至玻璃试管内，用氮吹仪在50 ℃恒温水浴条件下缓慢吹至近干状态，再用2.0 ml甲醇-二氯甲烷溶液（体积比为1∶99）溶解试管内的残渣，将溶解物上样至固相萃取小柱中进行净化，用10.0 ml甲醇-二氯甲烷溶液（体积比为5∶95）分2次洗脱，将全部洗脱液用液氮吹至近干。用甲醇（99.99%）定容至2.0 ml，再用注射器将溶液缓慢通过孔径为0.22 μm的滤膜，收集适量过滤后的溶液于样品瓶内待上机检测[9-10]。

1.3.2色谱条件色谱柱采用WondaSil C18-WR 5 μm（4.6 mm×250.0 mm），流动相为水-甲醇（体积比为4∶1），流速为1.0 ml/min，柱温为50 ℃。溶剂的梯度洗脱过程：15%甲醇0.01 min→20%甲醇4.00 min→35%甲醇11.00 min→70%甲醇31.00 min→90%甲醇31.01 min→70%甲醇34.00 min→15%甲醇34.01 min→15%甲醇40.00 min，停止。

2结果与分析

2.1数学模型的建立[11]

（1）检测3种氨基甲酸酯类农药在菜心中的残留量所用的数学模型为：

式中：X为鲜样中的农药含量（mg/kg），C为由标准曲线校正后试样中农药的质量浓度（mg/L），V为样品的定容体积（ml），m为鲜样质量（g），f为稀释因子。

（2）根据相对标准不确定度分量计算总相对标准不确定度，公式[12]为：

式中：Urelyi为总相对标准不确定度，Urelxi为各分量的相对标准不确定度，N为分量数。

（3）仪器按最小二乘法拟合工作曲线，计算标准曲线的标准差，公式为：

式中：SA为标准曲线的标准差，yi为第i次测得的色谱峰面积，a为曲线截距，b为曲线斜率，ci为第i次根据标准曲线计算得到的浓度，n为标准溶液的总测量次数。

（4）曲线拟合相对标准不确定度（UrelQ）计算公式为：

式中：SA为标准曲线的标准差，p为样品的测量次数，n为标准溶液的总测量次数，b为标准曲线的斜率，c1为通过标准曲线计算出的样品溶液浓度均值， c-为各标准系列溶液浓度的平均值，ci为第i次根据标准曲线计算得到的浓度。

2.2平行试验结果

在菜心基质对照中分别按1.00 mg/kg的质量分数加入灭多威、甲萘威、克百威3种标样，共设6个重复。由表1可以看出，基质中灭多威、甲萘威、克百威的平均测定值（最佳估计值）分别为0.952 mg/kg、0.885 mg/kg、0.920 mg/kg。

2.3不确定度评价

在实验室数学模型的建立与分类过程中，检测样品（菜心）中农药残留量所用的主要不确定度来源见表2。

2.3.1由标准品引起的不确定度

2.3.1.1由标准物质本身引起的不确定度灭多威、甲萘威、克百威3种农药标准溶液的偏差统一为±0.5%。根据均匀分布分析得出，置信因子（k）=3=1.732，3种农残标准品的Urel标=0.5%/1.732=0.002 89。

2.3.1.2在标准品与标准曲线制作过程中由玻璃器皿产生的不确定度（1）容量瓶与移液管自身产生的不确定度。由检定证书可知容量瓶（容积为10 ml）的最大误差是±0.10 ml，移液管（容积为1 ml）的最大误差是±0.007 ml，根据均匀分布计算得到相对标准不确定度[13]：

U容量瓶=0.1/3=0.057 7 ml，Urel容量瓶=0.057 7 ml/10 ml=0.005 77（自由度为∞）;

U移液管=0.007/3=0.004 04 ml，Urel移液管=0.004 04 ml/1 ml=0.004 04（自由度为∞）。

（2）环境温度对容量瓶与移液管量取溶液时产生的不确定度。实验室的温度一般控制在（20±5） ℃[14]。乙腈膨胀系数为1 ℃ 1.36×10-3，玻璃器皿膨胀系数为1 ℃ 2.50×10-5，由于乙腈膨胀系远远大于玻璃器皿，因此忽略温度对玻璃器皿产生的膨胀影响，仅以温度造成的乙腈体积变化进行计算[15]。温度对容量瓶与移液管2个玻璃器皿量取溶液时的不确定度分别为：

Ut-容量瓶=10×5×1.36×0.001/3=0.039 3 ml，Urel t-容量瓶=0.039 3 ml/10 ml=0.003 93 （自由度为∞）;

U t-移液管=1×5×1.36×0.001/3=0.003 93 ml，Urel t-移液管=0.003 93 ml/1 ml=0.003 93 （自由度为∞）。

根据矩形分布[16]和公式（2）可得玻璃器皿总相对标准不确定度（Urelgla）为0.008 97。

2.3.1.3标准曲线拟合的不确定度对不同质量浓度的标准溶液系列做6个水平的检测，采取最小二乘法拟合标准溶液质量浓度-色谱峰面积曲线[17]，相关数据见表3。由最小二乘法拟合标准溶液质量浓度-色谱峰面积可得，灭多威、甲萘威、克百威的线性回归方程分别为Y1=4 970.2x1+5 105.4 （R2=0.999 9）、Y2=4 255.6x2+6 399.5 （R2=0.999 9）、Y3=2 606.2x3+2 696.8 （R2=0.999 8）。根据公式（3）可得灭多威、甲萘威、克百威的标准偏差分别为11 524.45、7 989.27、6 718.38。根据公式（4）可得灭多威、甲萘威、克百威的相对标准不确定度（Urelcur）分别为0.017 6、0.015 7、0.020 2。

由标准物质本身引起的不确定度，在标准品与标准曲线制作过程中由玻璃器皿产生的不确定度（Urelgla），由标准曲线拟合造成的不确定度是标准品物质产生总相对不确定度Urel标（总）的来源[18]，依据公式（2）（Urel标（总）=Urel2标+Urel2gla+Urel2cur），由灭多威、甲萘威、克百威的3种标准品产生的总相对不确定度（Urel标（总））依次是0.021 6、0.020 2、0.023 8。

2.3.2重复检测引起的不确定度样品的质量浓度通过仪器读数获取，由于用仪器重复检测样品时的峰面积存在差异，因此采用标准不确定度的A类评定法，即根据重复次数获得不确定度[19]。将3种农药标准品配成合适的质量浓度后重复检测6次，测定结果见表4。

根据JJF 1059-1999《测量不确定度评定与表示》，本试验仅检测6次，并根据极差法开展不确定度的评定[20]。查阅《极差系数及自由度表》可得：测量次数（n）=6，极差系数（C）=2.53，A-為6次检测峰面积的平均值。灭多威的标准不确定度（U仪）=R/C=65/2.53=25.69，重复检测灭多威的相对标准不确定度（Urel仪）= U仪/A-=25.69/93 638=0.000 274。同理，重复检测甲萘威、克百威的相对标准不确定度（Urel仪）分别为0.000 313、0.000 515。

2.3.3样品处理产生的不确定度称取样品用的天平与净化定容的玻璃器皿是制备样品过程中产生不确定度的2个主要因素[21]。本研究中精度为0.000 1 g的天平最大误差范围是±0.01 mg，置信区间为99%。在方法1.3.1中，样品的称取质量为25.000 0 g，根据正态分布分析可知，置信因子（k）为2.576[22]。移液管的不确定度参照方法2.3.1.2测定[23]，样品处理过程中的不确定度见表5。根据公式（2），3种样品处理过程中引起的总相对标准不确定度（Urel样）为0.004 294。

2.3.4结果分析产生的不确定度回收率是结果分析中产生不确定度的重要来源[24]，本试验采取0.010 mg/kg、0.050mg/kg、0.100 mg/kg 3个质量浓度检测灭多威、甲萘威、克百威3种农药的残留回收率的相对标准不确定度（Urel回），每个浓度设6次重复，结果见表6 [25]。采用标准不确定度的A类评定法检测本试验的回收率[26]，得到灭多威的U回=3.9/18=0.92，Urel回=0.92/87.5=0.010 5;同理，甲萘威、克百威的Urel回分别为0.011 6、0.011 3。

2.4总相对标准不确定度

试验全程产生的方法不确定度因子有4个，即标准品、仪器、样品与回收率[27]。根据表7中的分量与公式（2） [28]，得到总相对标准不确定度（UrelT）的计算公式：UrelT=Urel2标（总）+Urel2仪+Urel2样+Urel2回，其中灭多威的UrelT= 0.024 4，甲萘威的UrelT=0.023 7，克百威的UrelT=0.026 7。

2.5总扩展不确定度

在95%置信水平下，包含因子（k）=2，可得相对扩展不确定度（u）=UrelT×k[29]。根据2.2节中3种农药的最佳估计值，计算得到的扩展不确定度见表8。

3讨论

根据上述分析可知，灭多威、甲萘威、克百威3种残留量的扩展不确定度（置信水平为95%）分别为0.004 6 mg/kg、0.004 2 mg/kg、0.004 9 mg/kg。在本方法中，灭多威、甲萘威、克百威3种农药残留量的相对标准不确定度分量呈现的趋势为Urel标>Urel回>Urel样> Urel仪。分析相对标准不确定度分量对总相对标准不确定度的影响，有利于今后在检测过程中有针对性地降低结果的不确定度。

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（责任编辑：徐艳）