CD90在肝内胆管细胞癌中的表达及其与患者预后不良的关系

朱 彤， 饶井芬， 刘承一， 肇 爽， 张 力

1 承德医学院附属医院 肿瘤科， 河北 承德 067000； 2承德医学院， 河北 承德 067000

肝内胆管细胞癌是一种源于肝内胆管上皮细胞的原发性腺癌，在原发性肝癌中发病率仅次于肝细胞癌位居第2位，且近年来其发病率有所上升[1]。目前对于肝内胆管细胞癌主要以手术切除为首选治疗方式，但是由于患者早期诊断困难、手术切除率低以及术后容易转移复发等因素，患者预后情况并无明显提高[2-3]。因此，研究肝内胆管细胞癌的发生以及促进肿瘤转移复发关键因子，对于肿瘤的治疗以及预后改善具有着重要意义[3]。CD90是锚定于糖基磷脂酰肌醇的一种糖蛋白，在成纤维细胞、胸腺细胞、内皮细胞以及神经系统等多种细胞中均有所表达，目前研究[4-5]显示，CD90是肝细胞癌重要的一种抗原标志物，在肝细胞癌发病和转移中发挥着重要作用，而其在肝内胆管细胞癌中的表达情况及与患者预后相关性目前尚无相关报道。本研究旨在探讨CD90在肝内胆管细胞癌中的表达及与淋巴结转移和预后不良的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2013年3月-2016年3月承德医学院附属医院手术切除的肝内胆管细胞癌患者组织标本及其癌旁组织标本。另收集同期肝脏外伤手术中所取正常肝组织标本作为对照。肝内胆管细胞癌患者均行根治性切除术，且手术由同一组医师完成，均经术后病理检查证实为肝内胆管细胞癌。患者术前未行放疗、化疗等相关治疗；癌旁组织取自距离肿瘤组织边缘2 cm以外的区域。术中切取新鲜组织，分类收集并标记基本信息后迅速转移至液氮罐中暂存，最后转移至承德医学院附属医院标本库保存(-80 ℃)。排除合并严重心、脑、肾等系统疾病以及合并其他系统肿瘤患者。标本均在患者或家属知情同意情况下获取。本研究方案经由承德医学院附属医院委员会审批(批号：20121208)。

1.2 免疫组化检测及结果判读 将石蜡标本连续切片后置于恒温烘箱内烤片，脱蜡后进行乙醇脱水以及高压抗原修复；加入3%过氧化氢溶液以及稀释后的CD90鼠抗人单克隆抗体(北京博奥森科技有限公司)，置于4 ℃条件下孵育过夜；加入第二抗体以及DAB显色。采用显微镜观察，使用自来水冲洗终止染色。苏木素复染3 min后使用自来水清洗；使用浓度1%的盐酸乙醇适度分化，温水返蓝；最后将切片晾干后封片。

结果判断：将切片置于400倍显微镜下，任选5个视野进行观察。参照文献[6]结果判断标准，细胞质染色呈深黄色或黄色作为CD90阳性细胞，计算阳性细胞百分比并进行评分：0分(阳性细胞0)、1分(阳性细胞≤25%)、2分(26%<阳性细胞≤50%)、3分(50%<阳性细胞≤75%)、4分(阳性细胞>75%)；然后根据阳性细胞染色强度进行评分：0分(无显色)、1分(浅棕黄色)、2分(棕黄色)、3分(棕褐色)。将阳性细胞百分比评分与染色强度评分相加，评分0分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)、4～5分为中度阳性(++)、6～7分为强阳性(+++)。

1.3 术后随访 术后对患者进行随访，随访截止日期为2019年7月31日，分别以术后局部/远期复发以及死亡作为终点事件，分析患者术后无复发生存情况及总体生存情况。

2 结果

2.1 一般资料 共纳入49例肝内胆管细胞癌患者，其中男39例，女10例，年龄33～78岁，平均(53.27±12.95)岁；对照组40例，其中男31例，女9例，年龄25～74岁，平均(52.93±10.94)岁。2组患者性别、年龄差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

2.2 3组CD90蛋白表达情况比较 肝内胆管细胞癌组织CD90中强度阳性表达率为65.31%，癌旁正常组织CD90中强度阳性表达率为30.61%，正常肝组织CD90中强度阳性表达率为0。肝内胆管细胞癌组织中CD90蛋白中强度阳性表达率显著高于癌旁正常组织与正常肝脏组织(P值均<0.05)(表1)。

表1 3组CD90蛋白表达情况比较[例(%)]

注：与肝内胆管细胞癌组织比较，1)P<0.05；与癌旁正常组织比较，2)P<0.05。

2.3 CD90蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者临床指标的关系 CD90蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者TNM分期及肝门淋巴结转移有关(P值均<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤数目、肿瘤分化情况无关(P值均>0.05)(表2)。

2.4 CD90蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者预后的关系 CD90蛋白阴性/弱阳性表达患者术后无复发生存率及总体生存率均明显优于中/强阳性表达患者(χ2值分别为3.845、4.152，P值分别为0.025、0.021)(图1、2)。

3 讨论

肝内胆管细胞癌为原发性肝癌的一种，是继肝细胞癌的第二常见肝内恶性肿瘤，以淋巴结转移为特征，其肿瘤侵袭以及转移的恶性程度较肝细胞癌更高[6]。近些年来，肝内胆管细胞癌发病率明显上升，由于患者发病较为隐匿，临床表现缺乏特异性，患者早期诊断较为困难且术后复发率高，大部分患者在临床诊断时已经处于疾病晚期，手术治疗效果不佳甚至无手术指征，患者临床预后极差，已成为肝内原发性恶性肿瘤死亡的主要原因，因此对于肝内胆管细胞癌病理发展机制的研究有着重要的临床意义[7-9]。

CD90是免疫球蛋白超家族中的一员，其主要通过甘油二酯锚定于糖基磷脂酰肌醇的羧基端而附着于细胞膜上[10]。在血液干细胞中发现CD90蛋白的表达，经过6 d细胞因子的处理，CD90+细胞群进入细胞周期，而CD90-细胞群仍处于细胞静止期，提示CD90阳性表达可促进细胞增殖[11]。此外，有研究[12]显示，CD44+CD90+细胞亚群在小细胞肺癌中的成球能力更强，且具有上皮-间充质转化特征。而从胚胎干细胞中分选出来的CD90+细胞群增殖能力明显强于CD90-细胞群，且CD90随着胚胎干细胞的成熟表达逐渐降低[13-14]。而在前列腺癌组织标本中，同样发现CD90表达较正常前列腺组织高，且其在血管周围的表达水平更高，提示在肿瘤的生长以及血管形成过程中，CD90均发挥着重要作用[15]。

表2 CD90蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者临床指标关系分析[例(%)]

图1肝内胆管细胞癌患者术后无瘤生存情况分析

本研究结果显示，肝内胆管细胞癌组织CD90中强度阳性表达率为65.31%，癌旁正常组织CD90中强度阳性表达率为30.61%，正常肝组织CD90中强度阳性表达率为0，肝内胆管细胞癌组织中CD90蛋白中强度阳性表达率显著高于癌旁正常组织与正常肝组织(P<0.05)。提示在肝内胆管细胞癌发生发展过程中，CD90蛋白表达发挥着重要的影响，可能促进了肿瘤细胞的增殖。此外，本研究进一步分析了CD90表达与患者临床病理特征的关系，结果显示，CD90蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者TNM分期及肝门淋巴结转移有关(P值均<0.05)。提示CD90蛋白与肝内胆管细胞癌患者疾病进展密切相关，同时CD90可能促进肿瘤细胞的血行转移，与相关研究[16-17]报道结果相似。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示，CD90蛋白阴性/弱阳性表达患者术后无复发生存率及总体生存率均显著优于中/强阳性表达患者(P值均<0.05)，提示CD90表达与术后复发及生存情况密切相关，CD90蛋白高表达可促进肿瘤的术后复发，影响患者生存预后，可能与CD90促进肿瘤血行转移等因素有关[18-19]。有学者[20-21]从肝癌细胞株、肝癌患者组织以及血液中分选出CD90+细胞群，结果显示，与CD90-细胞群比较，CD90+细胞群具有更强的成瘤能力，且能够无限增殖，因此认为CD90+细胞群可能是“肝癌干细胞”。本研究也进一步证实了在肝内胆管细胞癌中，CD90对肿瘤的发生可能同样发挥了重要的作用。但是由于本研究纳入样本量有限，且肿瘤作为一种多因素影响的共同结果，CD90可能只是其中因素之一，还需要进一步深入研究分析。

综上所述，CD90在人肝内胆管细胞癌组织内高表达，且与患者肝门淋巴结转移及不良预后有关，在肿瘤发生发展及转移过程中产生了重要的影响。