响应面法优化香圆皮柠檬烯提取工艺

*ZHYLKOViachaslau

(1.浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310015; 2.白俄罗斯国立大学国际萨哈罗夫环境研究所,明斯克 220070)

香圆(CitruswilsoniiTanaka)属于芸香科柑橘属植物,主要产地为江浙一带[1],具有舒肝理气、宽中化痰之功效,在杭州良渚一带有香圆皮入茶而饮的传统。我国是农业大国,幅员辽阔,柑橘资源尤其丰富[2]。因此,柑橘类果皮资源化利用制备高附加价值产品对食品工业来说具有十分重要的意义[3]。柑橘类果皮精油(OEO)作为柑橘水果加工后最有价值的副产物之一,广泛应用于食品、香料、化妆品、医药等行业[4]。OEO富含单萜烯类化合物,主要成分为柠檬烯(Limonene)[5],即1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯,别名双戊烯、苎烯等,分子式C10H16。柠檬烯具有多种生理活性,作为食品添加剂具有防腐保鲜作用[4],在医药领域具有抑菌[6]、抗氧化[7]、抗肿瘤[8]等功效,此外,还可作为合成杀虫剂的原料[9]等。随着对柠檬烯作用研究的不断深入,最近,其应用领域也有新的拓展,如可在等离子聚合技术中制备新型膜材料的可再生前驱体[10]、可减缓机体衰老并延长寿命[11]等。

文献报道的柠檬烯提取方法主要有水蒸气蒸馏法、减压蒸馏法、有机溶剂浸提法、分子蒸馏法、超临界CO2萃取法、超声波辅助提取法等[12]。其中,水蒸气蒸馏法将含有挥发性成分的物料与水一起蒸馏,挥发性成分在水蒸气作用下形成油水混合物,经冷凝后分离,较之其它提取方法具有工艺流程简单、设备要求不高的优点,并且符合绿色化学的理念和循环经济的特性,从而具有较大的工业化应用价值。然而,在该方法中,精油提取后通常需要在较高的温度下蒸馏以将目标产物提纯,易造成组分的氧化和破坏。尽管采用减压蒸馏可避免高温操作,然而减压蒸馏并不利于溶剂回收。因此,在水蒸气蒸馏法提取精油后,可改进工艺,先用30～60 ℃沸程的石油醚萃取,然后在相对温和条件下进行常压蒸馏,利用石油醚馏分蒸出时带走低沸点的精油组分,以达到防止因高温导致目标产品损失和获得较高纯度柠檬烯产品的目的。

本文在前人研究的基础上,采用上述改进的水蒸气蒸馏法,在单因素实验的基础上,采用响应面分析法对香圆成熟果皮中提取柠檬烯工艺进行优化研究,以期为柑橘类果皮资源化利用及柠檬烯提取技术提供理论依据和借鉴参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香圆成熟果实 产地为浙江杭州;柠檬烯(95%)标准品 阿拉丁(上海)试剂有限公司;石油醚(沸程30～60 ℃)、无水硫酸钠、氯化铵、氯化钠、碳酸钙、碳酸钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;蒸馏水 实验室自制。

CPA225D分析天平 德国赛多利斯集团公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 杭州慧创仪器设备有限公司;RV10旋转蒸发仪 德国IKA集团公司;TENSOR27傅里叶红外光谱仪 布鲁克(北京)科技有限公司;7890A-5975CGC-MS联用仪 美国安捷伦科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水蒸气蒸馏法提取香圆皮精油 称取新鲜香圆成熟果皮20 g,研磨成糊状,放入250 mL烧瓶中,加入80 mL水(液料比4∶1 (mL/g)),加入1.00 g氯化钠,连接分水器和冷凝管,经油浴加热60 min后停止加热,将分水器中液体移入分液漏斗,并加入20 mL石油醚振荡后静置10 min,取上层油层加入无水硫酸钠干燥,抽滤除去固体杂质,得到除水后的香圆皮精油与石油醚混合物。

1.2.2 常压蒸馏法分离柠檬烯 将约20 mL精油与石油醚的混合物置入100 mL 单口烧瓶中,连接蒸馏装置和冷凝管加热至70 ℃,至不再有馏出液时停止加热,冷却至室温后收集烧瓶内柠檬烯产品。

柠檬烯产量(g)=最终产品质量(g)×柠檬烯含量(%)

1.2.3 单因素实验 液料比:按照1.2.1的方法,在香圆皮20 g,氯化钠1.00 g,提取时间60 min的条件下,分别设置液料比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 mL/g,检测柠檬烯得率。

盐的种类:按照1.2.1的方法,在香圆皮20 g,盐用量1.00 g,液料比4∶1 mL/g,提取时间60 min的条件下,分别设置氯化钠、氯化铵、硫酸钠、碳酸钠、碳酸钙为盐析组分及不加盐,检测柠檬烯得率。

盐用量:按照1.2.1的方法,在香圆皮20 g,液料比4∶1 mL/g,提取时间60 min的条件下,以碳酸钠为盐,分别设置其用量为0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g,检测柠檬烯得率。

提取时间:按照1.2.1的方法,在香圆皮20 g,料液比4∶1 mL/g,碳酸钠用量为1.00 g条件下,分别设置提取时间为30、40、50、60、70 min,检测柠檬烯得率。

1.2.4 响应面试验设计 在单因素实验基础上,进行响应曲面试验设计,选择料液比、盐用量、提取时间这3个因素作为自变量,以柠檬烯的得率为响应值。运用Box-Bchnken中心组合设计方案[13],利用Design-Expert 8.0软件对实验数据进行回归分析。试验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.5 GC-MS分析 根据总离子流图,采用峰面积归一化法计算产品组分相对含量。

气相色谱条件:ZB-5 ms毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.50 μm),起始温度80 ℃,保持2 min,以20 ℃·min-1升至250 ℃;进样口温度270 ℃;载气为高纯氦气,流速0.8 mL·min-1;进样量为1 μL。

质谱条件:离子源为EI,电子能量70 eV,离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,接口温度280 ℃。

1.2.6 红外光谱扫描 制样:将200 mg纯溴化钾研细混合,研磨至粒度小于2 μm粉末压片,用胶头滴管在纯溴化钾压片上滴1滴按照1.2.1方法制备的柠檬烯样品;检测:打开仪器外置电源预热稳定30 min经性能测试和背景扫描后(背景为空气)开始测定样品。工作光谱范围为4000～400 cm-1,分辨率为4 cm-1,扫描次数为64次。

1.3 数据处理

采用Excel数据处理软件进行单因素实验数据分析和图表制作,采用Design-Expert 8.0软件进行响应面试验设计分析。

2 结果与讨论

2.1 产品表征鉴定

2.1.1 产品的GC-MS分析 GC-MS分析的总离子流图如图1所示。根据NIST图库匹配结果,保留时间为5.5 min的组分确定为目标产品柠檬烯,气相含量为98.1%,其质谱图如图2所示。

图1 柠檬烯产品总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of the limonene product

图2 柠檬烯产品的质谱图Fig.2 Mass spectrogram of the limonene product

2.1.2 产品的红外表征 柠檬烯标准样品与所提取的柠檬烯产品样品红外表征对照结果如图3所示。柠檬烯标准样品中相关红外光谱特征吸收峰[14-15]归属如下:797.65、887.77 cm-1为碳氢键(C-H)的弯曲振动,1644.23 cm-1为碳碳双键(C=C)的伸缩振动,2921.02、2965.72 cm-1为碳氢键(C-H)的伸缩振动峰。柠檬烯产品样品呈现出与柠檬烯标准样品相类似的峰型,且在上述波数下均有相应的出峰位置。结合GC-MS分析结果,产品可确认为柠檬烯。

图3 柠檬烯标准样品(a)和柠檬烯产品(b)的红外谱图Fig.3 IR spectrogram of the standard limonene sample(a)and the limonene product(b)

2.2 单因素实验结果

2.2.1 液料比对柠檬烯得率的影响 适当的料液比(果皮质量与水的体积比)可使原料充分浸泡,达到更好的质壁分离的效果,精油组分更易、更快、更多渗出,从而提高柠檬烯的得率。由图4可知,柠檬烯得率开始随着液料比的增加而提高,这是因为水用量的增加不仅可浸出更多的组分,并且可产生更多的水蒸气形成油水混合物后带出产品。但在4∶1 mL/g后,柠檬烯得率开始下降,这可能是因为水用量的增加降低了盐浓度,从而减弱了盐析作用。因此,4∶1 mL/g为柠檬烯提取的最佳液料比。

图4 料液比对柠檬烯得率的影响Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of limonene

2.2.2 盐种类对柠檬烯得率的影响 盐析技术作为一项新型、简单、有效技术在生物质相关化学产品提取中应用广泛[16-17]。在水蒸气蒸馏时,加入无机盐可强化柠檬烯的分离效果。由图5可知,加入盐后,柠檬烯的得率有明显提高。不同盐的加入对柠檬烯得率的促进作用大小顺序如下:碳酸钠>硫酸钠>氯化钠>碳酸钙>氯化铵。碳酸钙在水中溶解度较低,故盐析作用较之其它盐相对较弱。氯化铵的盐析作用最弱,这可能是因为氯化铵在水溶液中呈弱酸性,且随着温度的升高酸性增加,柠檬烯在酸性条件下不稳定,可发生水合作用和异构化作用等[18]生成副产物,导致得率降低。碳酸钠的盐析作用最明显,这是因为碳酸钠是碱性盐,碱处理可解构植物纤维细胞壁[19],从而可有效促进组分的渗出。因此,进一步考察碳酸钠用量对柠檬烯得率的影响。

图5 盐种类对柠檬烯得率的影响Fig.5 Effect of salt types on extraction rate of limonene

2.2.3 盐用量对柠檬烯得率的影响 由图6可知,柠檬烯的得率先随着碳酸钠用量的增加而增加,当用量为1.00 g时得率达到最大值,随后随着碳酸钠用量的增加而下降。这可能是因为,尽管盐析作用可使柠檬烯的得率增加,然而香圆皮中柠檬烯的量是一定的。在低浓度下,水溶液的蒸气压随着盐浓度的增加而降低,故在大气压恒定的情况下,水的沸点升高[20]。水蒸气量的减少将不利于柠檬烯产品的带出,故得率随之降低。因此，适宜的盐用量为1.00 g。

图6 盐用量对柠檬烯得率的影响Fig.6 Effect of salt dosage on extraction rate of limonene

2.2.4 提取时间对柠檬烯得率的影响 由图7可知,柠檬烯得率一开始随着提取时间的增加而增加,当提取时间大于60 min后,柠檬烯的得率增量不明显,这可能是因为柠檬烯已基本分离完全,时间的延长对得率的影响不明显。故从效率角度考虑,60 min为柠檬烯提取的最佳时间。

图8 液料比和盐用量交互作用对柠檬烯得率的影响Fig.8 Interaction of liquid-to-solid ratio and salt dosage on the extraction rate of limonene

图7 提取时间对柠檬烯得率的影响Fig.7 Effect of extraction time on extraction rate of limonene

2.3 响应面优化试验

根据Box-Benhnken设计原理,进行了3因素3水平共17个响应面分析试验,具体结果如表2所示。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results for response surface test

2.3.1 模型建立和显著性分析 利用Design-Expert软件对响应面试验数据进行分析和多元回归拟合,建立以柠檬烯得率为函数的二次回归方程,并对回归方程进行方差分析和显著性检验,结果见表3。柠檬烯得率(Y)与料液比(A)、盐用量(B)、提取时间(C)的二次回归方程为:Y=-3.61700+1.02457A+0.90900B+0.11340C+0.25000AB+0.00100AC-0.00400BC-0.14825A2-0.85200B2-9.07500×10-4C2。

表3 响应面试验回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model for response surface test

图9 液料比和提取时间交互作用对柠檬烯得率的影响Fig.9 Interaction of liquid-to-solid ratio and extraction time on the extraction rate of limonene

图10 盐用量和提取时间交互作用对柠檬烯得率的影响Fig.10 Interaction of salt dosage and extraction time on the extraction rate of limonene

说明该模型方程能够解释98.72%的响应值变化,可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。此外,A、C、AB、A2、B2、C2均对柠檬烯得率有极显著(P<0.01)影响。

2.3.2 响应面交互作用分析 将模型中液料比、盐用量、提取时间的其中一个因素固定在0水平,得到另外2个因素的交互影响结果(图8～图10)。液料比和盐用量的交互作用最为显著,相比而言,液料比和提取时间的交互作用、盐用量和提取时间的交互作用不显著,与方差分析结果一致。

2.3.3 验证性实验 响应面试验预测的最佳提取条件为:液料比4.5570∶1,碳酸钠用量1.0549 g,提取时间62.6652 min。考虑到实验室实际操作,提取条件调整为:液料比4.6∶1,碳酸钠用量1.05 g,提取时间63 min。在此条件下,柠檬烯得率理论值可达2.75%。通过实验证实,此时柠檬烯得率为2.76%,与理论值十分接近,实验结果与模型符合良好,说明该模型能较好地预测柠檬烯得率。

3 结论

水蒸气蒸馏法提取香圆皮柠檬烯具有操作简单、易于工业化的优点。本实验在单因素实验基础上,选择料液比、盐用量、提取时间这3个因素作为影响因子,采用响应面分析优化香圆皮柠檬烯提取工艺,最优条件为液料比4.6∶1,碳酸钠用量1.05 g,提取时间63 min。在此条件下,柠檬烯得率理论值可达2.75%,验证值为2.76%,与理论值十分接近。该试验结果可为后续香圆皮等柑橘类果皮柠檬烯提取工艺研究提供参考,具有一定的理论意义及应用价值。