固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定市售卤肉制品中5种杂环胺含量

,*

(1.甘肃农业大学,甘肃省干旱生境作物学重点实验室,甘肃兰州 730070; 2.甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070; 3.兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730000)

杂环胺(HAs)是一系列含有至少一个杂环的化合物,由碳、氢及氮原子组成,它们是在烹调富含蛋白质的食物如红肉、家禽和鱼类时产生的强致突变物和致癌物[1-2]。影响肉制品中杂环胺的形成有物理因素和化学因素,其中物理因素包括肉与肉制品的类型、加热温度和时间、加热方式等;化学因素包括pH、多糖、氨基酸和肌酸酐、脂肪、脂肪氧化及抗氧化物作用[3-6]。动物实验研究表明,HAs 能诱导啮齿类和灵长类动物的多种器官产生肿瘤,并能引起哺乳动物的基因突变、染色体畸变和姐妹染色体互换[7],长期食用含有微量HAs的熟食会引起人体器官的严重疾病,最终导致各种类型的癌症[8-9],因此,HAs的存在与否和危害成为消费者和研究人员关注的主要问题。国际癌症研究署将2-氨基-3,8-二甲基咪唑[4,5-f]喹喔啉(MeIQx),2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]喹啉(MeIQ)和2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]吡啶(PhIP)等几种类型的HAs列为人类的可能致癌物[10]。目前,已经在热处理食品中检测到了近30种HAs[11]。我国目前尚未建立HAs相关限量标准,也缺乏对卤肉制品中的HAs含量测定方法研究。为了评价HAs对人类健康的潜在威胁,研究建立检测食品中杂环胺的方法很有必要。文献报道检测HAs的方法主要有高效液相(紫外、荧光)检测法[12-14]和液相色谱-串联质谱法[15-18],分析HAs的前处理方法主要有液-液萃取[19]、固相萃取[20-21]。由于杂环胺是富含蛋白质的食品在加工过程中产生的有毒有害物质,属于痕量物质,因此,对样品预处理和检测器的灵敏度要求很高,高效液相色谱法(紫外检测器)难以准确地定性和定量,而荧光检测器虽然灵敏度较高,但仅能测定可产生荧光信号的杂环胺,具有一定的局限性。液相色谱-串联质谱法灵敏度较高,是目前测定痕量物质的优选方法。本文旨在建立卤肉制品中5种杂环胺的预处理方法和LC-MS/MS测定方法,为评定杂环胺对人类健康的潜在威胁提供基础保障,为加强食品安全督查提供科学方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

对照品:MeIQ(2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]-喹啉,2-amino-3,4-dimethyl-imidazo[4,5-f]-quinoline,CAS No. 77094-11-2)、MeIQx(2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉,2-amino-3,8-dimethyl-imidazo[4,5-f]-quinoxaline,CAS No. 77500-04-0)、4,8-DiMeIQx(2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉,2-amino-3,4,8-trimethyl-imidazo[4,5-f]-quinoxaline,CAS No. 95896-78-9)、7,8-DiMeIQx(2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑[4,5-f]-喹喔啉,2-amino-3,7,8-trimethyl-imidazo[4,5-f]-quinoxaline,CAS No. 92180-79-5)、PhIP(2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4,5-b]-吡啶,2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]-pyridine,CAS No. 105650-23-5) 纯度均≥98%，国家标准物质中心;样品采集 在兰州市超市、个人摊点和专卖店随机购买9种新鲜的卤肉制品(鸡肉制品:A、B、C、D、E;猪肉制品:F、G、H、I),剔除筋膜和骨头、搅碎,每个样品重复采样3次;乙腈、甲酸和甲醇 色谱纯,德国Merck公司;其他试剂均为国产分析纯试剂。

LC-MS/MSAgilent 1290 series液相色谱仪,配有G1322A脱气系统、G1312B SL二元泵、G1357D高精确度自动进样器(HiP ALS SL+),Agilent 6460四极杆串联质谱仪,配有电喷雾离子源(ESI,G1948B) Agilent Technologies;AB104-N电子天平 Mettler Toledo公司;RE-52 C旋转蒸发仪 郑州市亚荣仪器有限公司;SUPRA 22K高速离心机 Hanil 公司;KH3200B型超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司;Milli-Q超纯水系统 Millipore公司;固相萃取小柱聚苯乙烯二乙烯苯萃取柱(Poly-Sery PSD,3 mL,500 mg)、Waters Oasis HLB萃取柱(6 mL,500 mg)、Waters Oasis MCX萃取柱(6 mL,500 mg)、Waters C18(3 mL,500 mg) 上海玉博生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准贮备液和标准工作溶液的制备 分别称取5种对照品5 mg(精确到0.01 mg),用甲醇溶解,并定容至25 mL容量瓶中,此贮备液浓度均为200 μg/mL;准确移取相同体积的各储备液,用0.0217 mol/L甲酸水溶液-乙腈混合溶液(9∶1,v/v)稀释成为浓度为10、5、1、0.5、和0.1 μg/L混合标准中间工作溶液,基质匹配标准工作溶液为空白鸡肉和猪肉样品的提取液。所有的标准溶液于棕色瓶中置于-18 ℃保存。

1.2.2 样品制备 准确称取试样2 g(精确到0.01 g)于50 mL离心管中,加10 mL 40 g/L NaOH-甲醇溶液,均质1 min,于30 ℃超声提取10 min后,5000 r/min离心10 min,取上清液,重复此步骤1次,合并上清液。

固相萃取小柱(Poly-Sery PSD,3 mL,500 mg)依次用2 mL甲醇、3 mL 4 g/L NaOH溶液活化。准确移取2.5 mL提取液加入固相萃取小柱中,弃去流出液。依次用3 mL 4g/L NaOH-甲醇溶液、2 mL正己烷淋洗,每次淋洗均抽干柱内液体,然后用乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,v/v)洗脱3次(2、1、1 mL),洗脱流速小于1 mL/min。洗脱液于35 ℃减压旋转蒸发至近干,残渣用1 mL甲醇涡旋溶解,用0.22 μm有机相微孔滤膜过滤,待LC-MS/MS测定。

1.2.3 LC-MS/MS分析 液相色谱分离条件:ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,5 μm),柱温35 ℃,流动相A为0.0217 mol/L甲酸水溶液,流动相B为乙腈,梯度洗脱程序为90% A(0～0.5 min)→85% A(0.5～3 min)→80% A(3～3.5 min)→80% A(3.5～6 min)→65% A(6～7 min)→90% A(7～8 min)→90% A(8～9 min),流速0.3 mL/min,进样量10 μL。

质谱条件:电喷雾离子源(ESI),正离子扫描、多反应监测(MRM)模式;毛细管电压+3.2 kV;锥孔电压+1 kV;离子源温度120 ℃;脱溶剂温度350 ℃;喷雾气为氮气(0. 31 MPa);载气流速10 L/min,温度350 ℃;鞘气流速11 L/min,温度350 ℃;脱溶剂气流速500 L/h;锥孔反吹气流速50 L/h;质量扫描范围80～1000 m/z;扫描时间0.05 ms。优化后的碎裂电压、碰撞能量、定性离子和定量离子等参数见表1。Agilent Mass Hunter工作站(Agilent Technologies,美国)用于控制仪器、数据采集和结果分析。

表1 优化后的质谱参数Table 1 The parameters optimized of mass spectrometry

1.2.4 方法验证 本研究在实验室内进行分析方法的验证。在空白鸡肉和猪肉提取液中加入系列混合标准工作溶液,经LC-MS/MS 测定,以峰面积为纵坐标y,以添加浓度为横坐标x建立HAs的线性回归方程,并以信噪比(S/N)分别为3和10确定方法的定性限(LOD)和定量限(LOQ)。基质匹配溶液中的混合标准工作溶液的浓度为:10、5、1、0.5、和0.1 μg/L。方法的准确度和精密度通过测定日内和日间加标回收率评价,加标浓度为0.5、1和5 μg/kg。日内分析时,每个浓度水平重复测定6次;日间分析时,每个浓度水平重复测定3次,连续测定3 d。

1.3 数据处理

数据分析与图表均采用Microsoft Excel(2013)软件完成,杂环胺含量用平均值与标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 样品制备

2.1.1 提取溶剂选择 食品组成成分复杂,且HAs在食品中的含量很低,有效的样品制备方法是准确测定物质含量的前提。本文参照文献方法[11,14-15],并稍作修改,对比了乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙酸乙酯-氨水混合溶液(98∶2,v/v)、乙酸乙酯与正己烷混合溶液(9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,v/v,均添加1%氨水)、4 g/L NaOH-甲醇、4 g/L NaOH-乙腈11种溶液的提取回收率。在空白鸡肉样品中(n=6)添加各目标化合物1 μg/mL的标准溶液,PSD固相萃取柱为净化、富集小柱,依次用3 mL 4 g/L NaOH-甲醇溶液和2 mL正己烷淋洗,然后用乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,v/v)洗脱。实验表明,碱性提取溶液的回收率高于其他溶液的回收率,且4 g/L NaOH-甲醇溶液的提取率最高,可达76%～120%(图1)。说明碱性条件有利于杂环胺化合物从肉中析出,可能是由于这类物质含有-NH2,具有一定的碱性。因此,本实验选用4 g/L NaOH-甲醇溶液作为提取溶剂。

图1 提取溶剂选择Fig.1 Determination of extract solution

注:提取溶剂,1：乙酸乙酯;2:乙腈;3:甲醇;4:乙酸乙酯-氨水(98∶2,v/v);5:乙酸乙酯-正己烷(9∶1,v/v)+1%氨水;6:乙酸乙酯-正己烷(8∶2,v/v)+1%氨水;7:乙酸乙酯-正己烷(7∶3,v/v)+1%氨水;8:乙酸乙酯-正己烷(6∶4,v/v)+1%氨水;9:乙酸乙酯-正己烷(5∶5,v/v)+1%氨水;10:4 g/L NaOH-甲醇,11：4 g/L NaOH-乙腈。

2.1.2 固相萃取柱选择 有效地去除分析检测中的干扰物质,得到完全分离、对称性好的目标化合物的色谱峰,是准确定性和定量的基础。本实验参照王敏等[16]方法,并稍作修改,比较了HLB、C18、MCX和PSD 4种固相萃取柱对5种杂环胺加标提取回收率的影响。在空白鸡肉样品中(n=6)添加各目标化合物1 μg/mL的标准溶液,以4 g/L NaOH-甲醇为提取溶液,依次用3 mL 4 g/L NaOH-甲醇溶液和2 mL正己烷淋洗,然后用乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,v/v)洗脱。研究表明,PSD小柱对5种杂环胺有很好的保留,经过淋洗和洗脱,能很好地纯化此5种杂环胺化合物(图2)。通过方法准确度和精密度实验,准确度和精密度偏差均小于10%。因此,本实验选用PSD固相萃取柱为净化柱。

图2 固相萃取柱选择Fig.2 Determination of solid phase extraction column(SPE)

2.1.3 淋洗和洗脱溶剂选择 淋洗液和洗脱液是影响净化效果和回收率的重要因素。本实验参照文献方法[15-16],并稍作修改,在空白鸡肉样品中(n=6)添加各目标化合物1 μg/mL的标准溶液,以4 g/L NaOH-甲醇为提取溶液,PSD固相萃取柱为净化、富集小柱,比较了先用4 g/L NaOH-甲醇或4 g/L NaOH-乙腈溶液淋洗,再用甲醇、正己烷、甲醇-水溶液(1∶9,2∶8,3∶7,4∶6,5∶5,v/v)、乙酸乙酯与正己烷混合溶液(9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,v/v,均添加1%氨水)等多种溶液分别淋洗,确定最佳淋洗剂后,以乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,v/v)用作洗脱液的净化效果和回收率。结果显示,弱碱性溶液与有机试剂结合用作淋洗液洗脱后的杂质较少,先用3 mL 4 g/L NaOH-甲醇溶液淋洗,抽干柱内液体,然后用2 mL正己烷淋洗,抽干柱内液体,最后用乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,v/v)洗脱3次(2、1、1 mL),净化效果较好,回收率可达76%～127%(图3,图4,图5)。原因可能是4 g/L NaOH-甲醇溶液淋洗去除了亲水性杂质,正己烷淋洗去除了疏水性杂质。

图3 淋洗液选择Fig.3 Determination of clean-up solution

注:先用4 g/L NaOH-乙腈溶液淋洗,然后分别用以下溶液淋洗;1:甲醇;2:正己烷;3:甲醇-水溶液(1∶9,v/v);4:甲醇-水溶液(2∶8,v/v);5:甲醇-水溶液(3∶7,v/v);6:甲醇-水溶液(4∶6,v/v);7:甲醇-水溶液(5∶5,v/v);8:乙酸乙酯-正己烷溶液(9∶1,v/v)+1%氨水;9:乙酸乙酯-正己烷溶液(8∶2,v/v)+1%氨水;10:乙酸乙酯-正己烷溶液(7∶3,v/v)+1%氨水;11:乙酸乙酯-正己烷溶液(6∶4,v/v)+1%氨水;12:乙酸乙酯-正己烷溶液(5∶5,v/v)+1%氨水;洗脱溶剂为乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,v/v)。

图4 淋洗液选择Fig.4 Determination of clean-up solution

注:先用4 g/L NaOH-甲醇溶液淋洗,然后分别用以下溶液淋洗,1:甲醇;2:正己烷;3:甲醇-水溶液(1∶9,v/v);4:甲醇-水溶液(2∶8,v/v);5:甲醇-水溶液(3∶7,v/v);6:甲醇-水溶液(4∶6,v/v);7:甲醇-水溶液(5∶5,v/v);8:乙酸乙酯-正己烷溶液(9∶1,v/v)+1%氨水;9:乙酸乙酯-正己烷溶液(8∶2,v/v)+1%氨水;10:乙酸乙酯-正己烷溶液(7∶3,v/v)+1%氨水;11:乙酸乙酯-正己烷溶液(6∶4,v/v)+1%氨水;12:乙酸乙酯-正己烷溶液(5∶5,v/v)+1%氨水;洗脱溶剂为乙醇-二氯甲烷溶液(9∶1,v/v)。

图5 洗脱液选择Fig.5 Determination of elution solution 注:乙醇-二氯甲烷溶液的体积比分别为9∶1,8∶2,7∶3,6∶4。

2.2 MRM离子选择

检测药物残留时,欧盟委员会规定(Commission Decision 2002/657/EC)[22]至少有4个识别点才能对药物进行确证。LC-MS/MS检测中,母离子和子离子分别可获得1个和1.5个识别点。本实验中5种杂环胺均采用一个母离子和2个子离子进行测定,因此,均获得4个识别点。分别采用各目标化合物1 μg/mL的标准溶液,在电喷雾正离子模式下进行母离子全扫描,得到化合物的分子离子,以分子离子为母离子,对其进行二级质谱分析,母离子进入二级质谱,将发生断裂或重排等反应产生不同的离子碎片,选取其中信号较强、干扰较小的子离子组成监测离子对(响应最高的子离子作为定量离子,响应次高的离子作为定性离子)。5种杂环胺的质谱分析参数见表1,MRM色谱图见图6。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性关系与检出限 被分析物的色谱峰峰型对称、没有干扰因素时,根据保留时间可以对被分析物进行定性,根据 MRM 色谱峰面积定量。本实验以信噪比(S/N)分别为3和10时测定各化合物的LODs和LOQs。各化合物的LODs在0.01～0.1 μg/kg,LOQs在0.025～0.25 μg/kg。在空白基质提取液中添加系列混合标准工作液进 LC-MS/MS分析测定,以化合物的定量离子色谱峰面积为纵坐标,化合物添加浓度为横坐标进行线性回归,得到标准曲线方程。5种杂环胺在添加浓度水平范围均有良好的线性关系,决定系数(R2)在0.9976～0.9997之间(表2)。

表2 5种杂环胺的标准曲线、决定系数、检出限和定量限Table 2 The linear equations,decisive coefficients(R2),LODs and LOQs of 5 kinds of HAs

表3 5种杂环胺化合物的回收率实验结果Table 3 The result of recoveries of 5 kinds of HAs

注:a为加标回收率%,b为相对标准偏差%。

图6 卤鸡肉空白样品中添加 5种杂环胺标准品的MRM色谱图Fig.6 MRM chromatograms of a blank spiked with 5 kinds of standards of HAs 注:A为总离子色谱图,B1与B2、C1与C2、D1与D2、E1与 E2、F1与F2分别为MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQxE、 7,8-DiMeIQx和PhIP的提取离子色谱图。

2.3.2 方法的准确度和精确度 分别在卤鸡肉和卤猪肉空白样品中添加 0.5、1和5 μg/kg 3个水平标准工作溶液,进行提取回收实验,以评价方法的准确度和精密度。日内分析时,每个添加浓度水平进行6个重复测定,日间分析时,每个添加浓度水平进行3个重复测定,连续3 d重复测定。5种化合物在空白样品中的平均添加回收率为76.9%～127.7%，日内相对标准偏差(RSD)为1.0%～9.5%,日间相对标准偏差(RSD)为2.1%～8.7%(表3),日内、日间相对标准偏差均小于10%,回收率和相对标准偏差均符合国内外相关标准和法规的要求,可用于检测实际样品。

2.4 样品测定

采用上述建立的方法,对从市场购买的9种卤肉样品进行测定。在D样品和I样品中分别检测出了MeIQ和MeIQx,含量分别为0.16和0.57 μg/kg,其他样品均未检测到杂环胺。李可等[12]认为与超市和专售店相比,个人摊点肉制品中HAs的含量相对较高,且酱卤鸡腿、酱卤烧鸡和叫花鸡皮中 HAs 的含量分别是鸡肉(不带皮)HAs 含量的2.8、1.5和1.5倍。邵斌等[19,23]研究发现牛肉干中HAs总含量为16.65～60.38 ng/g;烧鸡鸡皮中PhIP含量为7.04 ng/g。潘晗等[24]调查研究了国内不同地区肉制品中的9种杂环胺含量,结果表明华东地区和西北地区的肉制品中总HAs含量显著高于其他地区。由此可见,富含蛋白质的肉类在烹调过程中产生了危害人们健康的杂环胺,虽然其含量处于ng级,但是危险性不容忽视。

3 结论

以卤肉制品为检测对象,建立了LC-MS/MS快速检测MeIQ、MeIQx、4,8-DiMeIQx、7,8-DiMeIQx和PhIP 5种杂环胺的方法。回收率和相对标准偏差均符合国内外相关标准和法规的要求。GB 5009 243-2016方法中此5种杂环胺的检出限为0.1～0.3 μg/kg,定量限为0.5～1.0 μg/kg[25]。本实验测定方法在信噪比(S/N)分别为3和10时各药物的LODs在0.01～0.1 μg/kg,LOQs 在0.025～0.25 μg/kg,精密度好,较国标方法灵敏度更高,能满足微量有害物质的检测需求。