甘肃特产药材红芪actin基因片段的克隆及序列分析△

何军刚，强正泽，马冬妮，冯晓莉，李成义

甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

目前，有关植物次生代谢产物的机制研究是分子生物学研究的热点领域之一。其主要是对野生植物资源中的优异基因进行鉴定和途径解析，通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术检测其表达量，此时首先需要确定一个表达稳定的内参基因[1]。肌动蛋白(actin)是真核生物细胞中最丰富的蛋白质之一，是细胞骨架的重要微丝组分，参与细胞分裂、内吞、信号传导等细胞内多种生命运动[2]。Actin基因具有高度保守以及表达量稳定的特点，常被当作基因表达检测的内参基因[3]。相关研究已从金银花LonicerajaponicaThunb[4]、太子参Pseudostellariaheterophylla(Mig.)Pax.ex Pax.et Hoffm.[3]、浙贝母FritillariathunbergiiMig.[5]、山药DioscoreaoppositeThunb.[6]、当归Angelicasinensis(Oliv.) Diels[7]、甘草GlycyrrhizauralensisFisch.[8]等植物中克隆出了actin基因，该基因在此类植物中均呈现高度保守。

红芪Hedysari Radix为豆科植物多序岩黄芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根，是甘肃省的特产药材。其功效与黄芪相似，中医临床常用于治疗气虚下陷、痈疽疮疡、久溃不敛等证[9]。现代药理研究表明，红芪具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒等药理作用。此外，红芪还可以提高周围神经再生期间扩增[10-11]、增强放射敏感性[12]、延缓肺纤维化[13]、防治肝纤维化[14]及抗骨质疏松[15]。长期以来，对红芪的研究主要集中在对其活性成分的分析和分离中，但是关于红芪actin基因的研究尚未见报道。本研究主要通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和T-载体PCR克隆技术，首次克隆出了红芪的actin基因片段，为深入研究红芪其他优异功能基因的表达以及调控提供参考。

1 材料

1.1 试药

红芪种子于2019年3月购于甘肃陇南武都区红芪种植农户，经甘肃中医药大学李成义教授鉴定为多序岩黄芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的种子，剥去荚膜，挑选种粒均匀饱满、没有虫害破洞的种子作为培育材料。将种子用2%次氯酸灭菌浸泡5 min，然后用75%的浓硫酸浸泡4 min打破休眠，再用流水冲洗30 min，最后将处理过的种子摆放在润湿滤纸的培养皿上，放在人工植物培养箱中发芽(温度25 ℃，湿度65%～80%，光照8 h·d-1)。待到种子发芽，将其移栽至装有蛭石和珍珠岩(5∶1)混合基质的花盆中，用不含琼脂的MS培养基溶液灌溉以保证其养分。以生长7周的幼苗作为提取RNA的实验材料。

植物总RNA小量抽提试剂盒(Magen生物有限公司)；cDNA合成试剂盒、核酸染料Gelview、PCR扩增试剂盒、50×TAE Buffer、快捷型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA Marker DL5000(北京Bio Teke有限公司)；T-载体PCR克隆试剂盒、感受态细胞、SOC培养基(TaKaRa公司)；Evo M-MLV反转录试剂预混液、SYBR Green®Premix ProTaqHS qPCR Kit(湖南艾科瑞生物工程有限公司)；其他试剂均为分析纯，购于Biosharp公司；引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2 仪器

Nano Drop 2000c型超微量分光光度计(上海土森视觉科技有限公司)；EC250-90型凝胶电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；ChemiDoc XRS+型凝胶成像分析系统(北京龙跃生物科技发展有限公司)；FTC-8000型PCR仪(加拿大枫岭生物技术有限公司)。

2 方法

2.1 红芪总RNA的提取和cDNA的合成

取生长7周的红芪幼苗100～150 mg，置于液氮中迅速研磨成细粉末，按照植物总RNA小量抽提试剂盒说明书步骤提取总RNA，吸取RNA 1.5 μL在超微量分光光度计上检测其质量分数和纯度，将剩余的RNA分装置于200 μL的无酶离心管中，置于-80 ℃冰箱保存。取RNA 5 μL用1%非变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。cDNA模板的合成参照说明书步骤进行，产物在-20 ℃保存。

2.2 引物设计与合成

在美国国家生物信息中心(NCBI)网上找到甘草(G.uralensisFisch.，EU190972)、大豆[Glycinemax(L.) Merr.，NM_001358094]、红车轴草(TrifoliumpratenseL.，AY372368)、蒺藜苜蓿(MedicagotruncatulaL.，XM_024774779)、柠条锦鸡儿(CaraganakorshinskiiKom.，FJ485727)等豆科植物actin基因CDS序列进行同源比对，找出高度保守区段，利用Primer 6.0软件设计引物。引物序列为actin-F：5′-ATGGTTGGG ATGGGTCAAAAGG-3′；actin-R：5′-TGTT GGAAGGTGCTGAGGGATG-3′。推测其片段长度950 bp左右。

2.3 RT-PCR扩增

以上述反转录得到的cDNA为PCR扩增模板，50 μL反应体系包括2×SuperTaqPCR MasterMix 25 μL、上下游引物各5 μL(10 μmol·L-1)、cDNA模板15 μL。反应程序：95 ℃起始模板变性3 min；95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，33个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束得到的PCR产物经过1%非变性琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统检测目的片段位置，然后用快捷型琼脂糖DNA 回收试剂盒回收片段。

2.4 阳性克隆的筛选与鉴定

根据T-载体PCR产物克隆试剂盒说明书，将回收片段与pMD19-T Vertor连接，加入等量的Solution I 16 ℃反应30 min，然后将连接产物转化至JM109感受态细胞100 μL中，冰浴30 min，42 ℃热击42 s，再冰浴1 min，加入SOC培养基890 μL，37 ℃振荡60 min，并接种到含有氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上，37 ℃过夜。次日早上随机挑取白色菌落7株，进行菌落PCR鉴定阳性克隆，用1%非变性琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，挑选阳性菌株用无菌水稀释，送至西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行测序。

2.5 Actin基因表达特性分析

用qRT-PCR技术分析红芪actin基因在根、茎、叶中的相对表达水平。取用MS营养液处理过的7周龄红芪的根、茎、叶，分别提取总RNA，通过Evo M-MLV反转录试剂盒合成cDNA。设计qRT-PCR引物为actin-F：5′-CAACCCAAAGGCCA ACAGA-3′，actin-R 5′-CACACCATCACCA GAGTCCAA-3′。25 μL反应体系为2×SYBR®Green ProTaqHS Premix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，无酶水10.5 μL。反应程序：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，循环40次；熔解阶段设置成FTC-8000 PCR仪默认值。数据分析采用FTC-8000型PCR仪系统软件和Excel 2016。

3 结果与分析

3.1 RNA纯度检测

实验采用7周红芪幼苗提取的总RNA，使用超微量紫外分光光度计测得A260/A280值为2.03(A表示吸光度)，经1%非变性琼脂糖凝胶电泳结果显示，28 S RNA和18 S RNA条带清晰可见(见图1)，没有杂带，并且前者的荧光强度约为后者的2倍，则说明本实验提取的总RNA纯度较高，可以用于后续RT-PCR。

注：M.Marker；1.总RNA。图1 红芪幼苗总RNA电泳图

3.2 红芪actin基因核心片段的克隆

以红芪幼苗总RNA为模板，通过RT-PCR成了1条长度约为950 bp的条带(见图2)，并且上下没有杂带，推测该片段就是所要的目的基因，还有待进一步鉴定。

注：M.Marker；1～2.RT-PCR产物。图2 红芪actin基因核心片段RT-PCR产物电泳图

3.3 阳性克隆鉴定

将回收的目的片段与T载体连接后，次日挑选7株菌落采用通用引物进行扩增，经1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测，5株菌落的条带位置在约950 bp，与RT-PCR扩增的位置一致，将这5个阳性克隆菌液送至西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行测序，序列见图3。

图3 Actin基因片段的核苷酸序列及推测的氨基酸序列

3.4 序列分析

经过测序得到了一段946 bp的actin基因片段序列，编码284个氨基酸。将该序列在GenBank进行Blast比对，发现该序列与甘草、花苜蓿、红车轴草的核苷酸同源性分别高达95.44%、94.42%、94.20%，将推测的红芪actin氨基酸序列与其他10种不同植物的进行多重比对，非保守氨基酸共12个(见图4)，相似性高达97%以上。结果表明，本实验所克隆的基因片段是红芪的actin基因片段，进一步验证了actin具有高度保守性。

3.5 红芪actin基因在不同部位中的表达

通过qRT-PCR法检测红芪actin基因在根、茎、叶不同部位中的Ct值，每个样品重复4次，Ct值为18～19，利用Excel 2016进行Ct值数据分析，计算各样品Ct值的标准偏差(SD)，SD越小，基因稳定性越好，若SD>1，则认为该基因不稳定[16-17]。本实验所克隆的actin基因，在根、茎、叶不同部位中的Ct值的SD分别为0.07、0.16和0.08，远小于1，说明该基因在红芪的不同部位中表达稳定，可以作为研究红芪其他优良基因的内参基因。红芪actin基因的熔解曲线(见图4)和不同组织中的Ct值柱状图(见图5)显示，该基因熔解曲线有良好的特异性，表现为单一峰，无非特异性荧光峰；且actin基因在红芪不同部位中表达量差异无统计学意义。

图4 Actin基因溶解曲线

图5 Actin基因在红芪不同部位的表达量

4 讨论

Actin是由375～377个氨基酸组成的单一多肽链的球状蛋白[18]，广泛存在于高等植物的各种组织细胞中，如根毛、茎韧皮部、叶表皮细胞、叶鞘细胞、花粉、卷须等，并且在维持植物细胞的正常生长、分化和繁殖等方面都具有重要意义[19]。Actin基因是由多基因家族编码的，因而形成了多种肌动蛋白异型体[20]。Hightowe等[21]研究表明，大豆与玉米肌动蛋白间存在8%～10%的氨基酸取代，而大豆肌动蛋白异型体之间仅存在6%～9%的氨基酸取代，因此，植物肌动蛋白具有高度的保守性。大量研究表明，actin基因无论是核苷酸序列还是其编码的氨基酸序列都具有高度的保守性和同源性。本实验所克隆的红芪actin基因与其他植物的核苷酸序列相似性在90%以上，其编码的氨基酸序列的相似性在97%以上，这将进一步证实了actin基因是一种高度保守的管家基因。

近年来红芪在药用和保健品中的应用受到越来越多的重视，对其品质的要求也在不断提高。目前研究发现，红芪的主要活性成分属于异黄酮类化合物，该类化合物在治疗心血管疾病、骨质疏松及神经退行性疾病方面具有良好的效果[22]。然而在红芪异黄酮类化合物合成机制及一些功能基因表达和调控的深入研究中往往需要内参对照。目前在NCBI网上数据库中未能搜索到红芪actin基因的序列。本实验结果显示，红芪actin基因在各部位中的Ct值稳定，保守性高，因此红芪actin基因可以作为研究其他优异基因表达的内参基因。本研究结果为红芪其他异黄酮合成酶基因的表达研究及红芪次生代谢产物与基因表达的相关性阐述提供了参考。