采自山东的几株野生羊肚菌鉴定*

赵建俊，吉建成，于国民，董相军，徐丽丽**

（1.青岛农业大学，山东 青岛 266109；2.内蒙古自治区克什克腾旗桦木沟林场，内蒙古 赤峰 025366；3.内蒙古自治区克什克腾旗林业局，内蒙古 赤峰 025378）

羊肚菌（Morchella spp.）又称羊肚子、羊肚蘑、羊肚菜、蜂窝蛾子等，属于子囊菌亚门（Ascomycota） 盘菌纲 （Pezizomycetes） 盘菌目 （Pezizales） 羊肚菌科（Morchellaceae）[1]，其属模式菌株是羊肚菌Morchella esculenta(L.)Pers.。《本草纲目》中对羊肚菌有“甘寒无毒，益肠胃，化痰利气”的描述；北美地区普遍认为羊肚菌是最佳食用菌；在欧洲许多国家对其喜爱程度仅次于块菌（Tuber sp.）[2]。羊肚菌子实体肉质鲜美，香脆可口，含有丰富的蛋白质、维生素、氨基酸和多糖等有效成分[3]，有较强的抗肿瘤，抗氧化，增强免疫力的作用，可减轻癌症患者放化疗引起的不良反应[4]。其内还含有一种羊肚菌独有的特殊的香味物质，即脯氨酸类似物，被广泛应用于调味品和食品添加剂领域[5]。因此，羊肚菌在食品、药用、保健品、化妆品等领域有广阔的应用前景。

生长环境及气候等因素的变化，可能会导致羊肚菌的形态特征发生很大改变，甚至同一物种不同发育阶段的形态也会有较大差异。传统的形态学分类造成了该属普遍存在同名异物和同物异名现象[2]。核糖体rDNA内转录间隔区 （internal transcribed spacer，ITS）序列分析技术，因其快速，准确，简便而被广泛应用于真菌的分子鉴定和系统发育分析中[6-7]。然而杜习慧等[8]发现基因库（GenBank） 中约66%的羊肚菌ITS序列均被贴上了错误的物种名称标签。基于荷兰皇家艺术与科学研究院真菌培养中心（CBSKNAW）网站，由包括我国在内的5个单位合作共同构建了一个网络数据库，即羊肚菌多基因序列模标数据库 Morchella MLST（multilocus sequence typing，http://www.cbs.knaw.nl/morchella/）[9]。该数据库中收录了大量准确鉴定的羊肚菌分子信息。随着羊肚菌系统发育学研究的深入，羊肚菌属内不同种的ITS序列一般只有几个碱基的差距，仅依靠ITS序列已不能准确鉴定羊肚菌的种属关系，并且从形态上进行不同种的分类也很困难，而多基因系谱一致性系统发育种识别法（genealogical concordance phylogenetic species recognition,，GCPSR）作为一种更完备的方法在近年来被广泛应用。因此，鉴定采用ITS、rpb1和ef1-α联合矩阵序列分析技术，对收集到的7株羊肚菌菌株进行分子鉴定和系统发育分析，以期为其人工栽培和菌种选育提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

于山东省潍坊市采集到野生羊肚菌6株，由羊肚菌子实体组织分离培养获得菌丝，编号分别为Me25、Me27、Me30、M51、Me4-1 和 Me1-2；于山东省临沂市采集野生羊肚菌1株，编号为Me91。

1.1.2 药品和试剂

分析纯试剂葡萄糖、琼脂、MgSO4·7H2O、KH2PO4、异丙醇、无水乙醇，柱式试剂盒E.Z.N.A.TM Fungal DNA Mini Kit等均购于生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 试验仪器

SW-CJ-2FD双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；PC214电子天平，OHOUS仪器有限公司；电热恒温培养箱，上海福玛实验设备有限公司；PCR仪，大龙医疗设备有限公司。

1.1.4 供试培养基

CPDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂2%、KH2PO41%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH自然。

1.2 试验方法

1.2.1 传统形态学鉴定

供试菌株样品参照《大型真菌图鉴》，按照子实体性状、大小和颜色等特征进行初步鉴定，并结合菌丝形态和菌核特性等微观特征，进行传统形态学分类鉴定[10]。

1.2.2 分子鉴定

1） 菌丝体DNA提取

采用Ezup柱式真菌DNA抽提试剂盒提取DNA，具体步骤详见试剂盒说明书。

2） 样品rDNA ITS、rpb1和ef1-α序列PCR扩增样品PCR扩增和测序引物见表1。

表1 PCR和测序引物Tab.1 PCR and sequencing primers

PCR扩增采用 50 μL体系，其中 2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10 μmol·L-1的引物各 2 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 补齐至 50 μL；ITS 序列PCR反应程序为94℃变性4 min，94℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，完成35个循环，72℃延伸10 min。ef1-α和rpb1的PCR反应程序为94℃初始变性 3 min，94℃变性 1 min，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，完成35个循环，72℃最终延伸10 min[11]。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，电压为100 V，产物和Marker上样量均为5 μL，电泳结果于BioDoc-It UVP凝胶成像系统成像。

3）扩增产物的序列测定

将1.2.2中得到的样品ITS、rpb1和ef1-α序列扩增产物直接送至上海生工公司测序。

4）扩增产物序列对比及分析

将测序得到的序列，通过NCBI在线Blast，与GenBank中已被测序成功的羊肚菌序列进行同源性比对。相关序列从Morchella MLST数据库下载。采用MEGA 5.0软件Neighbor-joining聚类分析方法构建系统发育树，后用Maximum-parsimony法构建联合矩阵系统发育树，并进行聚类分析[12]。

2 结果与讨论

2.1 样品子实体形态学鉴定

样品子实体参照《大型真菌图鉴》[10]，按照子实体大小、颜色和形状等分析，样品形态特征见图1。

由图1可知，Me25子实体较大，颜色土黄，高12 cm～14 cm，其中菌帽长7 cm～8 cm，表面有不规则凹坑；菌柄长5 cm～6 cm，污白色，表面光滑。Me27子实体较大，颜色浅土黄，高10 cm～12 cm，菌帽表面凹坑不规则，凹坑间的脊厚；菌柄5 cm～6 cm，粗壮，污白色，柄基部不膨大。M51子实体较大，颜色灰褐色，高13 cm～15 cm，其中菌帽长6 cm～7 cm，表面凹坑不规则，脊厚；菌柄长7 cm～8 cm，白色，表面有细小颗粒，菌柄基部稍膨大。Me91子实体中等大小，颜色土黄，高12 cm～13 cm，菌帽钝圆，表面有不规则凹坑，菌柄长，表面不光滑。Me30子实体较小，高约4 cm～6 cm，菌帽顶部钝圆，浅灰褐色，表面凹坑不规则，脊厚而脆，菌柄污白色，空心，偶有基部膨大。Me4-1子实体小，高约2 cm～4 cm，浅灰褐色，顶部钝圆。Me1-2子实体小，高约2 cm～4 cm，土黄色，顶部钝圆，生于火烧地上。

2.2 样品ITS、rpb1和ef1-α序列的PCR扩增及测序分析

试验样品的各位点片段经PCR扩增的产物进行凝胶电泳，各片段大小见图2。

将获得序列通过NCBI在线Blast对比，与Gen－Bank中已被测序成功的羊肚菌序列进行同源性比对，相似性超过99%的物种名称统计结果见表2。

表2 羊肚菌ITS、rpb1和ef1-α区序列测序结果Tab.2 Sequencing results of Morchella spp.ITS、rpb1 and ef1-α fragment

2.3 系统发育分析

采用MEGA 7.0对样品序列进行排列，采用ITS、rpb1、ef1-α序列联合矩阵分析构建系统发育树，结果见图3。

由图 3可以看出，供试菌株 Me25、Me27、Me51与宽圆羊肚菌Morchella robusta亲缘关系较近，Me30与羊肚菌Morchella esculenta亲缘关系较近，Me91与Morchella sp.Mes-19亲缘关系很近，Me1-2和Me4-1与小海绵羊肚菌Morchella spongiola亲缘关系很近。

3 讨论与结论

由于环境气候等外界条件和个体发育的改变，羊肚菌子实体的形状、大小等形态特征会发生较大变化，单一的传统形态学分类很难对其进行准确的分类鉴定。采用常规传统形态学鉴定，并结合ITS、rpb1、ef1-α序列联合矩阵分析，将得到的7株羊肚菌样品进行分类鉴定，确定供试菌株Me25、Me27、Me51为宽圆羊肚菌，Me30为羊肚菌，Me91为羊肚菌属某种，Me1-2和Me4-1为小海绵羊肚菌。

分子生物学结合系统发育学的研究，在真菌的分类鉴定中起到了主要作用[13]。rDNA的ITS、rpb1、ef1-α序列测定及限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（PCR RFLP） 技术等方法[14]的应用，成为了羊肚菌属分类鉴定和系统发育分析的有效手段。Taylor等[15]提出了多基因谱系一致性系统发育学物种识别法，即通过比对DNA核酸序列，进行系统发育分析，比较拓扑学关系，从而界定物种。该方法近年来逐渐被广泛应用，解决了分类学上的诸多问题，为羊肚菌的分类研究提供了新的思路。