乙醇回流法提取野生酸枣黄酮工艺研究

李小梅，杨冬雪，李忠琴

(雅安职业技术学院，四川 雅安 625000)

酸枣又名野枣、山枣、鼻涕果等，鼠李科枣属植物，广泛分布于我国各省多个山区。酸枣具有很高药用和食用价值，是我国卫生部审批通过的第一批药食同源植物之一[1]。酸枣全身皆为宝贝，酸枣仁是我国传统治疗焦虑失眠的名贵中药材[2-3]；酸枣根治疗失眠症，疗效显著；用酸枣叶泡水代茶以镇静；酸枣果肉营养丰富直接食用或泡水具有止咳、降血脂等功效，通过对虚弱患者临床观察，发现连续按时吃酸枣的患者康复速度是服用多种维生素的患者的6倍，证明野生酸枣具有防病、抗氧化、抗衰老、养颜益寿的作用[4-5]。野生酸枣共含维生素、有机酸、果胶、三萜类化合物、黄酮类化合物和生物碱等物质120多种。黄酮类化合物是酸枣中主要的化学成分之一，能够清除体内自由基，是一种天然有机抗氧化剂，引起学者们广泛关注[6-11]。目前，国内外对野生酸枣中黄酮的研究主要集中在酸枣仁，而对酸枣果肉、果皮和酸枣叶的研究较少。鉴于我国野生酸枣资源丰富，酸枣果肉、果皮和酸枣叶利用率低，为提高野生酸枣经济价值，本文采用紫外分光光度法以乙醇为溶剂，水浴加热回流法提取酸枣中黄酮，以黄酮百分含量为评价指标，优化提取工艺，为野生酸枣中黄酮的提取工艺提供实验参考。

1 试验部分

1.1 材料、试剂和仪器

材料：野生酸枣(采于雅安山区)。

试剂：芦丁标准品(纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司)；无水乙醇、95%的乙醇、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH均分析纯。

仪器：ME204E型电子天平：梅特勒-托利多有限公司；真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；FS-200g中药粉碎机：成都汉正科技有限公司； 恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司； 752型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

挑选颗粒饱满的野生酸枣洗净晾干，剥下果皮，分离果肉和果核，将残留在果核和果皮上的果肉洗净，把果核、果肉、果皮和酸枣叶均匀铺在4个洗净的盘子上，放入真空干燥箱中在40℃温度下烘干至恒重，用中药粉碎机粉碎，过40目筛，装入密封袋，置于干燥器中储存备用。

1.2 .2 绘制芦丁标准曲线

精密称取芦丁标准品20mg，用70%乙醇溶解，转移到100mL容量瓶中，用相同浓度的乙醇定容至刻度线，摇匀，即得浓度为200μg/mL的芦丁标准储备液。用移液管精密吸取0，1，2，3，4，5mL 芦丁标准储备液，分别置于25mL比色管中，依次加入5%NaNO2溶液1.5mL，摇匀，放置5min，加入10%Al(NO3)3溶液1.5mL，摇匀，放置6min，加入4% NaOH溶液7.5mL，用70%乙醇定容至刻度线，摇匀，放置10min。用紫外分光光度计在510nm波长处，以0mL管为参比，测定各管吸光度，平行测定3次，取平均值绘制标准曲线。

1.2.3 提取黄酮

准确称取3.000g样品，置于250mL圆底烧瓶中，加入一定浓度和体积的乙醇，在一定温度下加热回流提取。过滤提取液，除去残渣，滤液转入 100 mL容量瓶中，以相同浓度的乙醇定容至刻度线，摇匀，备用。

在其他条件一致的情况下，利用单因素实验，考察料液比、乙醇的浓度、回流温度和回流时间4个因素对黄酮含量的影响。

1.2.4 测定黄酮含量

在25mL比色管中准确吸取一定体积提取液，依次加入5%NaNO2溶液1.5mL，摇匀，放置5min，加入10%Al(NO3)3溶液1.5mL，摇匀，放置6min，加入4% NaOH溶液7.5mL，用70%乙醇定容至刻度线，摇匀，放置10min。用紫外分光光度计在510nm波长处，以0mL管为参比，测定样品溶液的吸光度，根据线性回归方程计算黄酮的含量。根据稀释倍数计算出各样品中黄酮的含量，计算公式如下：

其中：c为由标准曲线求出的稀释后提取液中黄酮的浓度，mg/mL； V：原提取液的体积，100mL； m：样品的质量，g； n：稀释倍数，酸枣仁和酸枣果肉稀释25倍，酸枣果皮和酸枣叶稀释60倍。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

标准曲线如图1所示。在0～40μg/mL浓度范围内，吸光度A与芦丁标准品浓度(μg/mL)

线性关系良好，线性回归方程为y = 0.011x + 0.002(R2=0.9990)。

图1 芦丁标准曲线

2.2 野生酸枣黄酮提取工艺

2.2.1 料液比对野生酸枣黄酮提取的影响

在乙醇体积分数为70%，提取温度为60℃，提取时间6h的条件下，选择不同的料液比提取样品中的黄酮，考察料液比对黄酮提取效率的影响，结果见表1。

表1 料液比对黄酮含量的影响(n=3)

试验结果发现，当料液比为1∶30(g/mL)时提取出黄酮含量最高，因此选择料液比为1∶30(g/mL)。

2.2.2 乙醇体积分数对野生酸枣黄酮提取的影响

在料液比为1∶30(g/mL)，提取温度为60℃，提取时间6h的条件下，选择乙醇不同的体积分数提取样品中的黄酮，考察乙醇体积分数对黄酮提取效率的影响，结果见表2。

表2 乙醇体积分数对黄酮含量的影响(n=3)

试验结果发现，当乙醇体积分数为70%时提取出黄酮的含量最高。这可能与70%乙醇的极性和样品中黄酮类化合物的极性最接近有关，因选择乙醇体积分数为70%。

2.2.3 提取温度对野生酸枣黄酮提取的影响

在料液比为1∶30(g/mL)，乙醇体积分数比为70%，提取时间6h的条件下，选择在不同温度下提取样品中的黄酮，考察提取温度对黄酮提取效率的影响，结果见表3。

表3 提取温度对黄酮含量的影响(n=3)

试验结果发现，提高温度，有利于增加黄酮含量，但温度超过80℃后，黄酮含量逐渐降低。这是因为升高温度可以加快分子运动，同时还能软化和破坏细胞壁有利于黄酮流出，但温度过高黄酮氧化含量降低。因选择温度为80℃。

2.2.4 提取时间对野生酸枣黄酮提取的影响

在料液比为1∶30(g/mL)，乙醇体积分数比为70%，回流温度80℃的条件下，选择不同时间提取样品中的黄酮，考察提取时间对黄酮提取效率的影响，结果见表4。

试验结果发现，随着提取时间增长，黄酮含量增加，但增加到一定程度后，黄酮含量变化不大，为了节约时间，选择提取时间为3h。

由上述单因素试验结果表明野生酸枣中黄酮提取的最佳工艺条件为：料液比为1∶30(g/mL)，乙醇体积分数为70%，提取温度80℃，回流提取3h。

表4 提取时间对黄酮含量的影响(n=3)

2.3 重复性和稳定性试验

2.3.1 重复性试验

精密称取同一样品(酸枣仁粉末)6份，按照最佳工艺条件制备提取液，按照1.2.4方法测定吸光度，计算黄酮的含量， RSD计算为2.37% ，表明本提取方法重复性好。

2.3.2 稳定性试验

将最佳工艺条件下制备的提取液放置0min、20min、40min、60min、80min后，按照1.2.4方法测定吸光度，计算黄酮的含量， RSD计算为2.54%，表明该工艺条件下制备出的提取液在显色80min内稳定性较好。

2.4 测定酸枣各部位中黄酮含量

精密称取样品3.000g，置于250mL圆底烧瓶中，加入90mL 70%的乙醇，在80℃温度下回流提取3h。所得提取液过滤，除去残渣，滤液转入 100 mL容量瓶中，以70%的乙醇定容，摇匀，待用。按照1.2.4方法测定和计算各样品中黄酮的含量，结果见表5。

表5 酸枣各部位黄酮含量 (n=3)

3 结论

本试验以乙醇为溶剂采用回流法提取雅安山区野生酸枣中的黄酮，以料液比、乙醇体积分数、提取温度、提取时间四个单因素研究提取工艺条件。结果表明最佳提取工艺条件为：料液比1∶30(g/mL)、乙醇体积分数70%、提取温度80℃、提取时间 6h，在此工艺条件下酸枣仁、酸枣果肉、酸枣果皮和酸枣叶中黄酮含量分别为2.439%、1.485%、8.254%、6.381%。并且考察了该方法的稳定性和重复性RSD分别为2.37%和2.54%，表明该工艺条件下提取的提取液在显色80min内稳定，重复性好，精密度高，适用于酸枣中黄酮提取，为雅安山区野生酸枣资源开发利用提供理论依据。