辅色剂对紫淮山花色苷稳定性的影响及其热降解动力学研究

张锦钰，郑棉文，王 锋*，李清明，苏小军,2，郭时印，邓朝阳，唐兰芳，谭兴和

(1.湖南农业大学食品科学技术学院， 长沙 410128； 2.湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室， 长沙 410128)

现榨饮料是指以新鲜水果、蔬菜或谷类、豆类等杂粮为原料，现场制作的供消费者直接饮用的非定型包装饮品。随着人们健康意识的提高，现榨饮料受到越来越多的关注，现榨饮料行业作为餐饮业配套行业之一，也得到了迅速发展[1]。紫淮山营养物质丰富，鲜嫩多汁，且具有抗氧化、免疫调节、降血糖血脂等保健功效[2]，是现榨饮料良好的原料来源。由鲜嫩的紫淮山制成的现榨饮料，色泽艳丽，口感润滑，已成为很多餐饮店的招牌饮料，深受消费者喜爱。不过，新鲜幼嫩的紫淮山收获期较短，且不耐贮藏，使现榨饮料的原料来源受到限制。将紫淮山以浆液的形式保存起来，是解决这一问题的关键。然而，紫淮山因含有丰富的花色苷[3]，其浆液容易受到pH、光照、温度、金属离子、氧化还原剂等因素的影响[4]，出现降解、褪色、品质下降等现象。辅色剂可通过向花色苷溶液提供大量π电子，阻止水分子及亲核试剂对花色苷分子的攻击，增强花色苷稳定性[5]。柠檬酸、苹果酸、槲皮素、黄芩素、咖啡酸等均是果汁中常用的辅色剂[6-8]。不过相比于现榨水果饮料，现榨紫淮山饮料比较特殊，带有酸味和苦涩味物质的添加会使其口感变差，接受度降低。

谷胱甘肽(glutathione,GSH)和没食子酸(gallic acid,GA)不仅具有抗氧化、解毒、提高免疫力等功能，对花色苷色素也有辅色作用。Wu等[9]发现谷胱甘肽可以抑制葡萄汁中的酶促褐变和非酶褐变，增强花色苷的稳定性。Roidoung等[9]将没食子酸添加到蔓越莓汁中，发现蔓越莓花色苷的保留率提高。在我们前期的试验中发现，添加少量谷胱甘肽和没食子酸对现榨紫淮山饮料的口感几乎没有影响。本研究拟以谷胱甘肽和没食子酸作为辅色剂，探讨其对紫淮山花色苷降解率和颜色值的影响，并研究紫淮山花色苷在不同温度下的热降解动力学，得出热降解动力学方程，以期为紫淮山花色苷的辅色及提高紫淮山浆液的保藏稳定性提供理论基础与实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

紫淮山(DioscoreaalataL.)，采自湖南新邵县紫玉农业科技有限公司生产基地。

谷胱甘肽、没食子酸购于上海瑞永生物科技有限公司；盐酸、冰醋酸、无水乙酸钠、氯化钾均为国产分析纯。

1.1.2 仪器设备

PL03电子天平购于梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；UV-1800紫外可见分光光度计购于上海美普达仪器有限公司；5804R台式高速冷冻离心机购于德国Eppendorf仪器公司；电热恒温水浴锅购于北京市永光明医疗仪器厂；PHS-3C型PH计购于上海今迈仪器仪表有限公司；恒温培养箱购于上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 紫淮山色素液的制备

将新鲜无腐烂、大小均匀的紫淮山洗净、去皮、切分成均匀大小，按固液比1∶2加入蒸馏水打浆，避光浸提1 h(20 ℃)，4 500 r/min离心10 min，得到上清液即为紫淮山色素液，4 ℃冷藏保存，备用。

1.2.2 花色苷含量测定

采用pH示差法测定紫淮山花色苷含量[11]。取紫淮山色素液2 mL，分别用pH 1.0缓冲液和pH 4.5缓冲液定容至10 mL，室温放置20 min后，用紫外分光光度计扫描紫淮山色素液在450～700 nm波长范围内的吸光值，确定最高吸收峰的波长为510 nm，分别检测波长为510 nm和700 nm处吸光值A。花色苷含量按下列公式计算：

(1)

A=(Aλ510-Aλ700)pH1.0-(Aλ510-Aλ700)pH4.5

(2)

式中：MW为矢车菊-3-O-葡萄糖苷的相对分子质量449.2(g/mol)；DF为稀释因子；ε为矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数26 900；1为光程(cm)。

1.2.3 辅色剂对紫淮山花色苷降解率的影响研究

取适量紫淮山色素液，分别加入不同质量分数的谷胱甘肽和没食子酸，然后于25 ℃恒温培养箱中保存，以未添加辅色剂的为对照组(control check,CK)。每3 d测定一次花色苷的含量，共测6次，并计算第15天时花色苷的降解率。为消除微生物的影响，向每组待测样品中加入1%叠氮钠溶液10 μL。花色苷降解率计算公式如下：

花色苷降解率/%=

(3)

1.2.4 紫淮山花色苷热降解动力学分析

取适量紫淮山色素液，加入质量分数分别为0.03%的谷胱甘肽和0.2%的没食子酸，并设置空白为对照组(CK)。将三组紫淮山色素液分别放置于50、70、90 ℃恒温水浴锅中加热，定时测定花色苷含量，记录数据。采用动力学一级反应规律分析紫淮山花色苷降解过程[12,13]，按下式计算一级反应速度常数(k)、半衰期(t1/2)、活化能(Ea)和温度系数(Q10)：

ln(Ct/C0)=-kt

(4)

t1/2=ln0.5×k-1

(5)

lnk=lnk0-Ea/RT

(6)

Q10=(k2/k1)10/(t2-t1)

(7)

式中：C0为初始时刻花色苷含量(mg/L)；Ct为一定温度下加热t后花色苷含量(mg/L)；k为降解速率常数(min-1)；t为处理时间(h)；k0为频率常数；R为气体常数(8.314×10-3kJ/mol·K)；T为绝对温度(K)；k1为t1℃时的速率常数；k2为t2℃时的速率常数。

1.2.5 辅色剂对紫淮山花色苷色差影响研究

取适量紫淮山色素液，分别添加0.03%的谷胱甘肽和0.2%的没食子酸，并设置空白为对照组(CK)。将三组紫淮山色素液置于50 ℃恒温水浴锅加热，每隔4 h测定一次花色苷含量和色素液的亮度L*、红值a*和黄值b*，分析谷胱甘肽和没食子酸对紫淮山色素液热稳定性的影响。颜色值参数(a*、b*、L*)计算参照文献[14]。

τ=10-A

(8)

X=19.717τ450 nm+1.884τ520 nm+42.539τ570 nm

+32.474τ630 nm-1.841

(9)

Y=7.950τ450 nm+34.764τ520 nm+42.736τ570 nm

+15.759τ630 nm-1.180

(10)

Z=103.518τ450 nm+4.190τ520 nm+0.251τ570 nm

+1.831τ630 nm+0.818

(11)

L*=116(Y/Y0)1/3-16

(12)

a*=500[(X/X0)1/3-(Y/Y0)1/3]

(13)

b*=200[(Y/Y0)1/3-(Z/Z0)1/3]

(14)

式中：A为吸光度；Τ为透光率；X、Y和Z是根据国际光学委员会推荐的公式计算200～700 nm波长范围内的红、绿、黄三原色刺激值；X0、Y0、Z0是CIE (Commission International de L’Eclairage)推荐的标准白光的颜色三刺激值，X0=94.825，Y0=100，Z0=107.381。

1.3 数据处理

所有试验均重复3次，结果以平均值±标准差表示，数据采用Origin 8.5、Excel 2010、SPSS 19.0等软件进行分析，以P<0.05表示试验结果具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 谷胱甘肽和没食子酸对紫淮山花色苷降解率的影响

图1 谷胱甘肽和没食子酸对紫淮山花色苷含量随时间变化的影响Fig.1 The effects of glutathione and gallic acid on the content changes of purple yam anthocyanin over time

图2 谷胱甘肽和没食子酸对紫淮山花色苷降解率的影响Fig.2 Effects of glutathione and gallic acid on the degradation rate of purple yam anthocyanin 注：同一处理组小写字母不同表示差异显著(P<0.05)Note:Different lowercase letters in the same processing group indicates significant difference (P<0.05)

谷胱甘肽和没食子酸都是重要的抗氧化剂，与花色苷共存时，可抑制花色苷的降解[15,16]。如图1、2所示，在25 ℃条件下，紫淮山花色苷含量随着时间的增加而减少，添加谷胱甘肽和没食子酸的紫淮山花色苷含量明显高于对照组。当谷胱甘肽和没食子酸的添加量分别为0.03%和0.2%时，紫淮山花色苷的降解率分别为55.05%和60.07%，均低于对照组的74.52%，这一结果表明谷胱甘肽和没食子酸可以有效抑制紫淮山花色苷的降解。同时，谷胱甘肽和没食子酸的添加量越大，花色苷的降解率越小，不过质量分数为0.03%、0.04%和0.05%的谷胱甘肽对花色苷降解的抑制作用无显著性差异(P<0.05)；质量分数为0.2%、0.3%和0.4%的没食子酸试验组，花色苷的降解率也无显著差异，原因可能是谷胱甘肽添加量为0.03%时，紫淮山花色苷溶液基本完全辅色；没食子酸添加量为0.2%时，花色苷分子也与其基本完全结合，故继续添加谷胱甘肽或没食子酸对花色苷降解的抑制作用无显著增加。从节约资源方面考虑，选择0.03%谷胱甘肽和0.2%没食子酸进行后续试验。

2.2 紫淮山花色苷热降解动力学解析

由图3和表1可知，加入0.03%谷胱甘肽和0.2%没食子酸后，紫淮山花色苷在不同温度条件下的热降解皆符合一级降解反应动力学(R2>0.90)。观察花色苷降解速率常数(k)可知，随着温度的升高，试验组和对照组的k值均增大，花色苷的降解反应加快，不过，经谷胱甘肽和没食子酸辅色后的花色苷k值均显著低于对照组，半衰期(t1/2)和活化能(Ea)均显著高于对照组(P<0.05)，如在70 ℃条件下，对照组花色苷的半衰期为18.53 h，谷胱甘肽和没食子酸组的半衰期分别为38.29 h和26.35 h，是对照组的2.07倍和1.42倍。活化能代表物质在发生转变时需要越过能垒，能垒越高则物质的稳定性越高[17]，在本试验中对照组的活化能Ea为47.73 kJ/moL，明显低于谷胱甘肽组的60.71 kJ/moL和没食子酸组的53.48 kJ/moL，这一结果说明谷胱甘肽和没食子酸均能够增强紫淮山花色苷的热稳定性。Q10为温度系数，其值越大，表示热降解反应速率对温度变化越敏感，在50～70 ℃范围内，谷胱甘肽和没食子酸组的Q10均小于对照组，说明在低温条件下，添加谷胱甘肽和没食子酸对紫淮山花色苷降解的抑制作用较好。但在90 ℃时，辅色剂对紫淮山花色苷的辅色效果不明显，张丽霞等[18]在研究蓝莓花色苷时有同样的现象出现，这可能是由于花色苷受热后其结构发生转变，导致生色结构2-苯并吡喃盐和醌式假碱减少。

图3 紫淮山花色苷降解动力学分析Fig.3 Kinetics analysis of purple yam anthocyanin (a)对照组;(b)0.03% GSH组;(c)0.2% GA组(a)CK;(b)0.03% GSH processing group;(c)0.2% GA processing group

表1 紫淮山花色苷在50～90 ℃热处理条件下的热降解动力学参数Tab.1 Kinetic parameters of purple yam anthocyanin degradation at 50～90 ℃

2.3 辅色剂对紫淮山花色苷色差的影响

图4 谷胱甘肽和没食子酸对紫淮山花色苷溶液L*的影响Fig.4 Effects of glutathione and gallic acid on L*of purple yam anthocyanin solution

L*表示紫淮山色素液的明亮程度，其值越大表明溶液颜色越透亮。从图4可以看出，随着加热时间的增加，紫淮山花色苷溶液的亮度L*值呈逐渐增大的趋势，且对照组>0.2%没食子酸组>0.03%谷胱甘肽组，如在50 ℃水浴中保温20 h后，L*值分别上升了37.88%、33.32%、28.14%。加热会促进花色苷的降解，导致溶液颜色变浅、亮度增大，因此，上述结果也间接反映了花色苷的降解程度，且0.2%没食子酸和0.03%谷胱甘肽对花色苷的降解有一定的抑制作用。

图5 谷胱甘肽和没食子酸对紫淮山花色苷溶液a*的影响Fig.5 Effects of glutathione and gallic acid on a*of purple yam anthocyanin solution

a*代表紫淮山色素液的红值，值越大，溶液越偏向红色。加热会促使紫淮山花色苷的结构发生变化，使其由红色的黄烊盐阳离子式向蓝色醌型碱式转变[19]，从而导致花色苷溶液由紫红色变为蓝绿色，红值a*减小。如图5所示，随着加热时间的增加，紫淮山花色苷溶液的a*值呈逐渐降低的趋势，如在50 ℃水浴中保温20 h后，对照组、0.2%没食子酸组、0.03%谷胱甘肽组的a*值分别降低了44.70%、27.38%和24.95%，不过对照组a*值下降速度明显高于其他两组，说明没食子酸和谷胱甘肽对紫淮山花色苷具有辅色效应。

图6 谷胱甘肽和没食子酸对紫淮山花色苷溶液b*的影响Fig.6 Effects of glutathione and gallic acid on b* of purple yam anthocyanin solution

b*代表紫淮山色素液的黄值，值越大，溶液越偏向黄色。在加热条件下，花色苷会发生氧化、酶促褐变、抗坏血酸降解等化学反应[20]，使黄褐色物质积累，黄值b*增大。如图6所示，随着加热时间的增加，对照组紫淮山花色苷溶液的b*值呈逐渐增大的趋势，不过0.2%没食子酸组和0.03%谷胱甘肽组的b*值增幅较小，变化不明显，这说明没食子酸和谷胱甘肽能够改善花色苷的品质，抑制氧化和褐变反应的发生。

3 讨论

本试验表明，谷胱甘肽和没食子酸对紫淮山花色苷均有较好的辅色作用，且两者最佳添加量分别为0.03%和0.2%，在此添加量条件下，室温放置15 d后的紫淮山花色苷降解率分别为55.05%和60.07%，显著低于对照组的74.52%。添加谷胱甘肽和没食子酸后，紫淮山花色苷溶液的亮度(L*)、红值(a*)、黄值(b*)相比对照组变化较小，花色苷的品质也得到了较好的保留。谷胱甘肽结构中含有一个活泼的疏基硫原子，其极化形成的空d轨道重叠后亲核作用增强，在加成反应中的速度超过-NH，率先与羰基化合物加成[21]，这可能是其抑制花色苷褐变，增强花色苷稳定性的原理。没食子酸是一类无毒、易被人体吸收的天然多酚类物质，其苯环上的三羟基基团具有较高的还原能力和较低的O-H键断裂焓[16]，因此，没食子酸有较强的抗氧化作用，与花色苷共存时，两者能以氢键和范德华力作用结合，形成水平或垂直重叠的稳定复合物[4]，从而使花色苷呈色增强。

紫淮山花色苷在50、70、90 ℃下的热降解皆符合一级降解反应动力学规律；添加谷胱甘肽和没食子酸的花色苷溶液的k值均小于对照组，活化能Ea却比对照组的46.46 kJ/mol分别提高了13.10 kJ/mol和5.69 kJ/mol；同时，70 ℃时，谷胱甘肽和没食子酸组的半衰期分别是对照组的2.07倍和1.42倍，这说明谷胱甘肽和没食子酸能够增强花色苷的热稳定性。随着温度的升高，对照组和试验组的紫淮山花色苷降解速率均加快，这与苏帆等[22]所发现的酚酸对红肉苹果花色苷的辅色作用随着温度的升高而减弱的结果相一致。Jasmina[23]研究发现辅色剂与花色苷分子间的反应是一个放热过程，高温会促使两者分解。因此，即使在添加辅色剂的条件下，仍应尽量于低温环境中贮藏紫淮山浆液，以保持其颜色的稳定性。

谷胱甘肽和没食子酸具有抑制紫淮山花色苷降解、增强花色苷热稳定性以及延缓花色苷颜色值变化的作用，将谷胱甘肽和没食子酸作为紫淮山花色苷的辅色剂，可有效改善花色苷在保存期的稳定性并延长紫淮山浆液的保藏期。而谷胱甘肽和没食子酸复合剂对紫淮山花色苷的协同辅色效果如何，两者辅色的机理如何还有待进一步研究。