CD14、IL-4和TNF-α在健康人和慢性根尖周病患者组织中的免疫荧光定位*

王 刚， 李 娟， 黄世光

(1中山大学附属中山医院口腔分院牙体牙髓病科， 广东 中山 528404； 2暨南大学口腔医学院， 广东 广州 510632)

慢性根尖周病是由来自感染根管的感染刺激引起的宿主免疫反应，在根尖周病损组织中存在的各种炎症细胞、细胞因子和趋化因子可导致根尖周胶原纤维破坏，形成持续的炎症并伴随骨质的破坏吸收。研究显示，在人根尖周的病变组织中存在着大量的淋巴细胞(lymphocytes, LYMs)、中性粒细胞(neutrophil granulocytes)、巨噬细胞(macrophages, Mø)和浆细胞(plasma cells)等，另外可见成纤维细胞(fibroblasts, FBs)增生，新生的毛细血管常衬以肿胀的内皮细胞(endothelial cells, ECs)[1]。白细胞分化抗原14(cluster of differentiation 14, CD14)存在膜结合CD14(membrane-bound CD14, mCD14)和可溶性CD14(soluble CD14, sCD14)2种形式，mCD14主要表达于活化的中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、成熟单核细胞以及人牙龈成纤维细胞中[2]。白细胞介素4(interleukin-4, IL-4)是由Th2细胞分泌的细胞因子，能刺激活化B细胞和T细胞增殖、 CD4+T细胞分化成II型辅助T细胞，在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及IL-4参与了Th细胞免疫应答的调控过程[3-4]。IL-4是一种多功能细胞因子，可抑制T淋巴细胞功能以及单核/巨噬细胞的活化和效应作用，抑制Th1细胞因子，从而发挥抑炎作用, 促进根尖周组织的修复和局限炎症的免疫应答机制[3]。TNF-α主要是由活化的巨噬细胞分泌，中性粒细胞、NK细胞、成纤维细胞以及肥大细胞也可分泌TNF-α，并且对其免疫功能作出调节，在根尖周病变中起着骨破坏的作用[4-5]。根尖周病变的发病及修复机制非常复杂，目前，尚未见人慢性根尖周病组织中TNF-α-CD14和IL-4-CD14双阳性细胞表达的报道。因此，本实验采用免疫荧光双染色法，观察TNF-α-CD14及IL-4-CD14双阳性细胞在不同类型慢性根尖周病组织中的表达情况，并探讨TNF-α-CD14及IL-4-CD14双阳性细胞在慢性根尖周炎发病机制中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要材料和仪器

Mouse Anti-CD14(Santa Cruz)；Rabbit Anti-TNF-α和Rabbit Anti-IL-4(Abcam)；山羊抗鼠IgG(H+L) Alex Flour®555(Cell Signaling Technology)；山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour®488(Cell Signaling Technology)；4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; MP Biomedicals)；DAB显色试剂盒(ZLI-9019, 北京中杉金桥生物技术有限公司)。激光共聚焦显微镜(ZEISS)。

2 方法

2.1病例选择 选择2015年10月～2017年6月在中山大学附属中山医院口腔分院牙体牙髓病科并自愿接受本研究的病例，其中男性45例，年龄(38.0±12.5)岁，女性43例，年龄(34.0±14.5)岁,其中43例为临床诊断为根尖囊肿或慢性根尖周脓肿，接受根尖手术治疗或无法保留的病例，慢性根尖周脓肿23例，根尖周囊肿为20例。对照组为因正畸需要拔除的前磨牙及健康无冠周炎的第三磨牙，病例数为45例[年龄(32.0±18.4)岁]。患者年龄及性别均无显著差异(P>0.05)。收集患者病历时，各组男女比例和年龄层，在两个层次上无统计学差异。所有选取女性病例均否认怀孕、服用长效或短效避孕药病史；所有患者排除心血管或其他系统性疾病，并且至少3个月内未服用抗生素治疗。所有患者均需要签署知情同意书。

2.2实验分组 实验分为：(1)正常对照(healthy control)组(45例)：因正畸治疗需要拔除的牙周健康的前磨牙或没有冠周炎的智齿牙周膜组织，X线示根尖影像无明显异常，根尖孔发育完成，牙周膜影像光滑连续，无增宽;(2)慢性根尖周脓肿(chronic periapical abscess)组(23例)：因根管治疗效果不佳而行根尖刮治术或根尖切除术的刮除的根尖肉芽组织，或因牙槽骨吸收破坏严重导致无法保留需要拔除的患牙根尖肉芽组织，X线示根尖区典型的大片云雾状透射阴影;(3)根尖周囊肿(periapical cyst)组(20例)：X 线片显示患牙根尖周有圆形或椭圆形密度降低区，直径>1 cm，边界清楚有骨白线包绕，手术过程中观察到根尖区病变组织为内含液体或半固体的囊性组织。

2.3组织标本采集和处理 根尖周组织标本置于10%中性福尔马林固定液中浸泡24～48 h，制作5 μm厚度的连续切片，行HE染色，光学显微镜下观察各组的组织学变化。

2.4TNF-α-CD14和IL-4-CD14双阳性细胞免疫荧光双染色 Ⅰ抗为Mouse Anti-CD14、Rabbit Anti-TNF-α和Rabbit Anti-IL-4，稀释度为1∶100；Ⅱ抗为山羊抗鼠IgG(H+L) Alex Flour® 555和山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour® 488，稀释度为1∶200。组织切片经柠檬酸液修复，Ⅱ抗血清封闭，Ⅰ抗孵育，避光条件下Ⅱ抗孵育荧光染色，DAPI核染后，荧光显微镜观察。TNF-α和IL-4阳性信号为红色荧光， CD14免疫荧光阳性信号显现为绿色荧光，定位于细胞膜或细胞浆，同一视野下红色荧光与绿色荧光重叠后为橘黄色荧光；细胞核显现为蓝色荧光。组织切片由2名病理医师于荧光显微镜下盲法观察，参照李娟等[6]的计数方法，选取10个代表性连续视野(0.072 5 mm2/视野)，对DAPI阳性及表达TNF-α-CD14或IL-4-CD14双阳性细胞进行计数，获得双阳性细胞的密度(cells/mm2)，取平均值[7-8]。

3 统计学处理

数据以均数±标准误(mean±SEM)形式表示，采用统计软件SPSS 13.0分析处理。各组标本组织中TNF-α-CD14和IL-4-CD14双阳性细胞平均密度的比较采用完全随机设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Levene法进行方差齐性检验。若方差齐时，多个样本均数间每两个均数的比较选用Bonferroni法；方差不齐时选用Tamhane’s T2法[6]。以P<0.05认为差异有统计学意义。

结 果

1 各组HE染色结果

各组标本组织结果显示，正常对照组牙周膜组织主要由纤维构成，组织结构及形态基本完好；慢性根尖周脓肿组可见炎性肉芽组织，毛细血管和成纤维细胞增生，中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞等炎症细胞浸润，部分病变内部见上皮条索及上皮岛；根尖周囊肿组可见大块囊性结构组织，炎性肉芽包饶中央坏死崩解结构，纤维组织层以胶原纤维为主，肉芽组织细胞间水肿，囊壁上皮层下大量慢性炎症细胞浸润，含典型的铁血黄素和胆固醇晶体，见图1。

Figure 1.Histological changes of human periapical tissues (HE staining, the scale bar=50 μm). A: healthy control group; B: chronic periapical abscess group; C: fibrous layer of periapical cyst group; D: epithelium layer of periapical cyst group.

图1 各组样本HE染色结果

2 TNF-α-CD14双阳性细胞双染色结果

各组标本组织中TNF-α-CD14双阳性细胞双染色结果显示，正常对照组仅见少量散在分布的TNF-α-CD14双阳性细胞；根尖周囊肿组TNF-α-CD14双阳性细胞数量比正常对照组明显增加；慢性根尖周脓肿组中可见大量浸润的TNF-α-CD14双阳性细胞，见图2～4。

3 IL-4-CD14双阳性细胞双染色结果

各组标本组织中IL-4-CD14双阳性细胞双染色结果显示，正常对照组仅见少量散在分布的IL-4-CD14双阳性细胞；慢性根尖周脓肿组IL-4-CD14双阳性细胞数量比正常对照组明显增加；根尖周囊肿组中可见大量浸润的IL-4-CD14双阳性细胞，见图5～7。

Figure 2.TNF-α-CD14 double-positive cell staining results of healthy control group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: TNF-α+; C: DAPI+; D: merged.

图2 健康对照组TNF-α-CD14双阳性细胞双染色结果

Figure 3.TNF-α-CD14 double-positive cell staining results of chronic periapical abscess group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: TNF-α+; C: DAPI+; D: merged.

图3 慢性根尖周脓肿组TNF-α-CD14双阳性细胞双染色结果

4 TNF-α-CD14及IL-4-CD14双阳性细胞密度的比较结果

各组标本组织中TNF-α-CD14及IL-4-CD14双阳性细胞密度比较，结果显示：(1)2组慢性根尖周病组织中TNF-α-CD14及IL-4-CD14双阳性细胞密度较正常对照组显著升高(P<0.05)；(2)慢性根尖脓肿组TNF-α-CD14双阳性细胞密度较根尖周囊肿组显著升高(P<0.05)；(3)根尖周囊肿组IL-4-CD14双阳性细胞密度较慢性根尖脓肿组显著升高(P<0.05),见图8、9。

Figure 4.TNF-α-CD14 double-positive cell staining results of periapical cyst group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: TNF-α+; C: DAPI+; D: merged.

图4 根尖周囊肿组TNF-α-CD14双阳性细胞双染色结果

Figure 5.IL-4-CD14 double-positive cell staining results of healthy control group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: IL-4+; C: DAPI+; D: merged.

图5 健康对照组IL-4-CD14双阳性细胞双染色结果

讨 论

慢性根尖周炎的主要病理特征是炎症细胞的浸润及牙槽骨的吸收破坏[9]。促炎和抗炎细胞因子参与了根尖周疾病的介导及调控，炎症性骨吸收是由根尖周组织中的炎症或免疫细胞及其分泌的各种不同细胞因子所致，是免疫细胞、细胞因子以及其它炎性介质相互之间高度复杂共同作用的结果[10-11]。成骨与破骨的动态平衡是根尖周骨重建过程中的关键性环节[12]。

Figure 6.IL-4-CD14 double-positive cell staining results of chronic periapical abscess group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: IL-4+; C: DAPI+; D: merged.

图6 慢性根尖周脓肿组IL-4-CD14双阳性细胞双染色结果

Figure 7.IL-4-CD14 double-positive cell staining results of periapical cyst group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: IL-4+; C: DAPI+; D: merged.

图7 根尖周囊肿组IL-4-CD14双阳性细胞双染色结果

在本研究中，我们采集了慢性根尖周脓肿和根尖周囊肿的标本，以正常牙周膜组织作为对照。通过HE染色观察比较各组标本根尖周的组织学改变及炎症细胞浸润状态。最近的研究结果表明，Th1和Th2细胞因子在慢性根尖周炎的发病机制中发挥作用。Th1免疫应答参与了根尖周病变和骨质破坏的进展，而Th2细胞因子介导的炎症免疫机制在病变发展晚期发生的愈合过程中发挥重要作用[13-14]。然而，调节这些免疫炎症通路的机制尚未完全阐明。de Carvalho Fraga 等[15]观察到在根尖周囊肿中IFN-γ蛋白水平升高，而根尖肉芽肿中的IL-4表达更强。Ribeiro 等[12]通过检测根尖周囊肿中M2巨噬细胞和促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表达，评价Th1和Th2反应在根尖周囊肿中的作用。结果提示M2巨噬细胞参与根尖周囊肿的炎症反应，同时存在促炎的Th1相关细胞因子，表明促炎Th1因子和抑炎Th2因子驱动的免疫反应在根尖周病变中共存。研究表明，促炎Th1和抑炎Th2细胞因子均可调节IL-1的表达，IL-1被认为是骨破坏的中心介体，IL-6刺激骨吸收，而IL-4和IFN-γ对破骨细胞产生抑制作用，IL-4抑制促炎细胞因子(包括IL-1和TNF-α)的合成，TNF-α及IL-4参与了Th细胞免疫应答的调控过程[4, 10, 15-17]。

Figure 8.The density of TNF-α-CD14 double-positive cells. Mean±SEM.*P<0.05vshealthy control group;▲P<0.05vschronic periapical abscess group.

图8 各组根尖周组织TNF-α-CD14双阳性细胞密度的比较

Figure 9.The density of IL-4-CD14 double-positive cells. Mean±SEM.*P<0.05vshealthy control group;▲P<0.05vschronic periapical abscess group.

图9 各组根尖周组织IL-4-CD14双阳性细胞密度的比较

目前，尚未见人慢性根尖周炎组织中TNF-α-CD14及IL-4-CD14双阳性细胞表达的报道。为进一步研究CD14阳性细胞Th1和Th2极化情况，本实验选择TNF-α作为Th1细胞因子，IL-4为Th2细胞因子，采用免疫荧光双染色法，观察不同类型慢性根尖周病组织中TNF-α-CD14及IL-4-CD14双阳性细胞的分布并分析双阳性细胞的密度。本实验结果与Araujo-Pires等[18]和Fukada 等[19]的结果相似，Araujo-Pires等[18]观察到，根尖周病变的活动性与促炎介质如TNF-α、IL-21、IL-17和IFN-γ的高表达相关，而病变的非活动期与抑炎介质如Foxp3、IL-10、IL-9、IL-4和IL-22的表达相关。Fukada 等[19]的结果提示，炎症肉芽肿的破骨细胞活性与Th1反应相关，根尖周囊肿与Th2活性增强相关，但他们的报道并未分析具体免疫细胞炎症介质的表达情况。Rider等[20]研究表明，TLR2、TLR4和CD14是调节感染根管的混合感染及其所致根尖周组织破坏的关键因素。

综上所述，TNF-α-CD14及IL-4-CD14双阳性细胞如何参与根尖周病的免疫调控机制尚不清楚。根尖周组织中Th细胞因子的表达对根尖周病免疫病理的调节，以及Th1/Th2细胞因子间相互作用的机制尚需进一步探究。