长非编码RNA lncRNA ADAMTS9-AS2促进唾液腺腺样囊性癌侵袭转移的研究

武东辉， 朱韵莹， 梁坚强， 林钊宇， 李劲松

1. 广州市海珠区口腔医院口腔外科，广东 广州（510120）； 2. 中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科，广东广州（510220）

腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是唾液腺最常见的恶性肿瘤，主要来自唾液导管上皮，占恶性唾液腺肿瘤的四分之一。唾液腺腺样囊性癌具有神经浸润性生长和远处肺转移等特征［1-3］，远处转移是影响唾液腺腺样囊性癌患者的重要预后因素［4，5］。因此，探究 SACC 的神经侵袭和远处转移的机制对提高SACC 患者的存活率有重要意义。目前发现，长非编码RNA（longnocoding RNA，lncRNA）在多种肿瘤的发生发展起重要作用，本研究主要研究lncRNA 在SACC 侵袭、转移过程中是否起到重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SACC-83 和SACC-LM 细胞购自北京大学；SACC-LM 为源自SACC-83 肺转移的高转移细胞系。10%FBS（Invitrogen，美国）；RPMI-1640 培养基（Gibco，美国）；人类lncRNA 微阵列V3.0 芯片（上海博豪生物公司，中国）；TRIzol 试剂（Invitrogen，美国）；Prime Script TM RT 试剂盒（Takara Biotechnology，日本）；LightCycler 480 系统（Roche，瑞士）；Lipofectamine 3000 脂质体（Invitrogen，美国）；Transwell小室（BD Biosciences，美国）。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养 将SACC-83 和SACC-LM 细胞分别在含有10%FBS 的RPMI-1640 培养基中进行培养，37 ℃，5%CO2。

1.2.2 lncRNA 微阵列分析 使用人类lncRNA 微阵列V3.0 进行分析对SACC-83 和SACC-LM 细胞进行比较分析（该部分由上海博豪生物公司负责完成）。

1.2.3 RNA 提取和实时荧光定量PCR 使用TRIzol 试剂从组织或细胞中提取总RNA，并使用Prime Script TM RT 试剂盒同时根据制造商的说明书进行逆转录。使用LightCycler 480 系统进行定量实时PCR 检测，并将ADAMTS9-AS2 的相对表达标准化为GAPDH 的相对表达量。引物序列如下：ADAMTS9 - AS2：forward 5' - TTTACCATGCGCTGAGTGAG-3'，reverse 5'-AAAGTTGCGTCATGCTTCGG-3'；GAPDH：forward 5'- ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'，reverse 5'-GAGGCAGGGATGATGTTCTG-3'。

1.2.4 细胞转染 芯片结果显示长非编码RNA ADAMTS9-AS2 的表达在SACC-LM 中表达最高，靶向lncRNA 的siRNA ADAMTS9-AS2 以及对照siRNA由广州锐博公司合成提供。使用Lipofectamine 3000 脂质体介导转染，siRNA 最终浓度为50 nM，根据说明书进行转染。通过qRT-PCR 检测沉默效率。

1.2.5 侵袭迁移实验 ①迁移实验：消化并收集1× 105个肿瘤细胞加入到无血清培养基中，将200 μl 该细胞加到Transwell 小室的上室内，而下室中加入500 ul 含10% FBS 的完全培养基。37 ℃培养24 h 后，将小室放入4%多聚甲醛中固定10 min，随后浸入0.05%结晶紫溶液中染色2 min，擦去小室上层的细胞，PBS 冲洗后使用正置显微镜下观察计数。每个小室选取5 个视野拍照，所计细胞数取均值。②细胞侵袭实验：将Matrigel（无血清培养基稀释）溶解后，向Transwell 小室上室中加入50 μl，室温孵育1 h。随后消化重悬舌鳞癌细胞，将1 × 105个细胞接种于小室上层，下层加入500 ul 含10%FBS 的完全培养基，37 ℃培养30 个小时，其余步骤同迁移实验。

1.2.6 差异表达的lncRNA 与SACC 患者的临床病理特征和预后分析 SACC 患者为2003 年6 月至2017 年10 月在中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科就诊治疗的唾液腺腺样囊性癌患者共102 例，其中男女各51 例，年龄35～82 岁。所有患者术前均未接受任何化疗或放疗，病理确诊为腺样囊性癌。其肿瘤标本及肿瘤边界外约2 cm 的癌旁组织标本存放于液氮保存。所有患者采用电话及复诊的方式进行随访。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0 软件对数据进行分析，计量、正态分布数据用表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。α＝0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 芯片筛选SACC 细胞系内差异表达的lncRNA及qRT-PCR 验证

为了揭示lncRNA 对SACC 转移的调控作用，本实验使用lncRNA 芯片筛选SACC-LM 和SACC-83细胞中差异表达的lncRNAs（差异倍数＞2）并绘制热图（图1a）。为了验证芯片结果，本实验通过qRT-PCR 进行验证差异表达的候选lncRNA 在SACC-LM 和SACC-83 细胞中的表达水平（图1b）。芯片结果显示lncRNA ADAMTS9-AS2 的表达在SACC-LM 中表达最高，qRT-PCR 进一步验证了其在SACC-LM 中的高表达。

a: heat map depicting lncRNAs for which a two fold change in expression was found in the SACC-LM and SACC-83 cells; b:the expression levels of several significantly differentially expressed lncRNAs were validated by qRT-PCRFigure 1 Microarray screening of lncRNA differentially expressed in SACC cell lines and validation of qRT-PCR图1 芯片筛选SACC 细胞系内差异表达的lncRNA 及qRT-PCR 验证

2.2 敲低ADAMTS9-AS2 抑制SACC 细胞迁移和侵袭

为了验证ADAMTS9-AS2 对SACC 细胞迁移和侵袭功能的调控作用，设计了两条靶向ADAMTS9-AS2 的 siRNAs 并将该 siRNAs 转入 SACC-LM 细胞内，通过qRT-PCR 检测沉默效率（图2）。此外，Transwell 结果显示敲低ADAMTS9-AS2 的表达后，侵袭和迁移的SACC-LM 细胞数目显著降低（图3）。

2.3 ADAMTS9-AS2 与SACC 患者的临床病理特征和预后分析

检测lncRNA ADAMTS9-AS2 在SACC 及癌旁样本的表达，结果发现ADAMTS9-AS2 在SACC 组织内显著高表达，此外ADAMTS9-AS2 在发生远处转移的SACC 患者中的表达较未发生转移的患者显著上调（图4）。

Figure 2 The ADAMTS9-AS2 levels were examined in the SACC-LM cells transfected with siRNAs targeting ADAMTS9-AS2 or siRNA controls图 2 qRT-PCR 检测 ADAMTS9-AS2 siRNAs 在SACC-LM 细胞内的沉默效率

Figure 3 The SACC-LM cells transfected with siR-ADAMTS9-AS2 were subjected to chamber assays图3 Transwell 实验检测ADAMTS9-AS2 敲低后SACC-LM 细胞迁移和侵袭能力的变化

*P＜0.05,**P＜0.01Figure 4 The ADAMTS9-AS2 expression levels were detected by qRT-PCR in the clinical SACC patients with metastasis or without metastasis and adjacent normal salivary tissues图4 qRT-PCR 验证ADAMTS9-AS2 在癌旁正常组织，发生转移以及未转移的临床样本中表达情况

ADAMTS9-AS2 表达与SACC 患者的临床病理特征之间的关系见表1。 ADAMTS9-AS2 表达与SACC 患者的肿瘤大小（P＝0.017），临床分期（P＝0.033）和是否发生远处转移（P＝0.035）及预后（P< 0.001）密切相关。而ADAMTS9-AS2 表达与SACC 患者的性别或年龄未发现有统计学意义。

3 讨 论

目前发现多种lncRNA 参与多种肿瘤生物功能的调控，包括增殖、凋亡、自噬、迁移和侵袭，是后基因组时代的重要发现［6-7］，lncRNA 的异常表达通过顺式或者反式作用参与肿瘤的发生发展，可能成为肿瘤辅助诊断或治疗的新靶点［8-11］。

表1 ADAMTS9-AS2 表达与102 例SACC 患者的临床病理特征之间的关系Table 1 Correlation of clinicopathologic status and the expression of lncRNA ADAMTS9-AS2 in the SACC patients

由于目前对lncRNA 在SACC 侵袭、转移中的作用研究甚少，本研究初步探讨lncRNA 是否参与调控SACC 发生发展，筛选出促进SACC 侵袭、转移的关键lncRNA，为进一步的机制研究提供基础。本研究使用lncRNA 表达谱芯片来筛选SACC 肺转移株SACC-LM 细胞和原发灶SACC-83 细胞中的lncRNA 表达谱。lncRNA 表达谱芯片及 qRT-PCR 结果显示，lncRNA ADAMTS9-AS2 是 SACC-LM 细胞内上调最明显的lncRNA，ADAMTS9-AS2 是蛋白质编码基因 ADAMTS9 的反义转录物［12］，在高转移细胞系SACC-LM 细胞内上调表明其在SACC 的发生、发展和侵袭、转移中可能发挥重要作用，它的表达水平可能与SACC 侵袭、转移能力相关。通过敲低ADAMTS9-AS2，SACC-LM 细胞的迁移和侵袭能力显著下降，提示在SACC 的侵袭转移过程中，ADAMTS9-AS2 可能扮演了重要角色，它的高表达提高了SACC-LM 迁移和侵袭能力。SACC 患者临床病理特征显示，lncRNA ADAMTS9-AS2 是 SACC 组织上调明显的lncRNA，肿瘤体积大、临床分期晚，则ADAMTS9-AS2 表达水平高，提示ADAMTS9-AS2的高表达参与促进了SACC 的发生发展过程。在远处转移病例中，ADAMTS9-AS2 呈高表达，且差异有统计学意义，说明ADAMTS9 -AS2 在SACC 侵袭转移过程中起重要作用。一般情况下，肿瘤的侵袭性、转移性越强，则肿瘤患者的预后就越差，ADAMTS9-AS2 高表达，相应患者的预后就越差，差异有统计学意义，ADAMTS9-AS2 可能可以成为SACC 预后不佳的标志物之一。但也有研究表明，ADAMTS9-AS2 在某些种类的肿瘤中却起到了不同的作用，例如ADAMTS9-AS2 在肺癌低表达，它通过PI3K/Akt 途径抑制肺癌细胞增殖，迁移和侵袭［13］。高表达的 ADAMTS9-AS2 通过 miR-223-3p/TGFβR3 轴抑制卵巢癌发生发展［14］，与本研究的结果不一致，可能ADAMTS9-AS2 在不同肿瘤中其生物学功能不同。有研究发现ADAMTS9-AS2 发挥竞争性内源性RNA 作用，直接靶向miRNA 及其靶基因以促进头颈癌进展［15］，比如 miR-600/EZH2 可以抑制肿瘤进展，在舌鳞癌中，ADAMTS9-AS2 与miR-600 内源性竞争EZH2，而起到促进肿瘤侵袭转移的作用［16］。

本研究证实了lncRNA ADAMTS9-AS2 在发生转移的SACC 样本和高转移潜力的SACC-LM 细胞内特异性高表达，ADAMTS9-AS2 的表达与SACC 的预后及临床病理特征密切相关。下一步将重点研究ADAMTS9-AS2 内源性竞争RNA 比如miR-600/EZH2 等的具体机制，来进一步阐明ADAMTS9-AS2促进SACC 肿瘤发生发展侵袭转移的作用机制。