EUROPattern全自动免疫荧光核型和滴度判读系统检测抗核抗体的应用评价

徐红星， 刘艺， 朱琴芳， 徐卫东

(南京医科大学附属苏州市立医院本部检验科， 江苏 苏州 215002)

抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)是自身免疫性疾病最重要的诊断指标之一[1]。抗核抗体靶抗原位于真核细胞细胞核中，但随着人们对抗核抗体的深入研究，胞质和细胞骨架中也相继发现[2]。目前发现有临床意义的抗核抗体很多，如抗dsDNA抗体、抗Scl-70抗体、抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗Sm抗体、抗Jo-1抗体等[3]。常用抗核抗体测定方法有间接免疫荧光法(indirect immuno-fluorescence method，IIF)、免疫印迹法、酶联免疫吸附法[4]等。其中间接免疫荧光法是抗核抗体检测的参考方法[5-6]。

目前大部分实验室都用间接免疫荧光法检测抗核抗体，然后在荧光显微镜下用目视方法判读，但是目视方法判读烦琐、效率低且人与人之间判定结果差异较大。随着检测标本的不断增加，目视方法判读已不适用于临床。为了满足临床的需求，能更快、更准确地提供诊断依据，全自动荧光判读仪应运而生，使得荧光核型判读自动化和标准化。本研究评价EUROPattern全自动荧光判读系统与目视方法判读抗核抗体的结果是否有一致性和可比性，以期为临床提供高效率、高精准性的实验报告，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 研究对象

随机选取2017年9月至2018年3月江苏省苏州市立医院(本部)诊断为自身免疫性疾病且抗核抗体阳性的患者177例，男34例，女143例，年龄20～70岁，平均51岁。健康对照组选自同期体检者25例，男6例，女19例，年龄15～80岁，平均58岁。

1.2 主要试剂与仪器

欧蒙Sprint XL全自动间接免疫荧光操作分析仪及抗核抗体IgG检测试剂盒，EUROPattern Suit全自动荧光判读仪，OLYMPUS荧光显微镜及成像系统。

1.3 检测方法

1.3.1 间接免疫荧光法 应用Sprinter XL全自动间接免疫荧光仪进行抗核抗体的检测，试剂盒中生物载片上包被Hep-2细胞及猴肝细胞作为基质抗原，检测血清中抗核抗体。检测时仪器自动将血清标本稀释100倍，取25 μL加样至基质片上，室温反应30 min使血清中抗体与抗原结合，用缓冲液浸泡5 min洗去未结合抗体；加异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体与抗原抗体复合物结合30 min，洗去未结合标记抗体。甘油封片，自动判读、目视判读抗核抗体核型和滴度。

1.3.2 全自动荧光判读系统 EUROPattern Suit全自动荧光判读系统由多个硬件和软件模块组合。使用时，打开全自动显微镜背部的开关，双击“ELO”图标，输入用户名密码登入软件，根据日期新建一个任务，输入或导入患者信息，点击“Create Protocol ”创建实验流程，按顺序放好基质片，点击“Start EPA microscope” 启动全自动显微镜进行自动判读，自动判读完成后审核结果，将结果输出至LIS系统。

1.4 统计学处理

应用SPSS 19.0统计软件进行处理，采用χ2检验分析两种方法检测阳性率及方法性能评价指标间是否存在显著性差异，用Kappa一致性检验分析两种方法抗核抗体结果符合率，假设检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法检测抗核抗体阳性率及方法学性能评价指标比较

以临床诊断作为标准，比较全自动判读系统和目视判读方法判读抗核抗体结果的阳性率及灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值。实验结果显示，全自动判读系统和目视判读方法在自身免疫病组中的阳性检出率分别为97.2%和98.3%，健康组中阳性检出率分别为4.0%和0，总体的阳性检出率分别为85.6%和86.1%，两种判读方法的阳性检出率均无显著性差异，见表1；两种方法判读抗核抗体结果的灵敏度、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值，其差异也均无统计学意义(P均>0.05)，见表2。

表1 全自动判读系统和目视判读方法抗核抗体阳性率比较

表2 全自动判读系统和目视判读方法性能评价指标比较

2.2 两种抗核抗体荧光判读方法一致性分析

全自动判读系统和目视判读方法在177例自身免疫病患者中荧光核型同时阳性有169例，而25例健康对照组中同时阴性有24例，其符合率分别为95.4%和96.0%，总体符合率为95.5%，两种方法一致性检验结果Kappa值为0.816(介于0.075～1.000)，见表3。

表3 全自动判读系统和目视判读方法抗核抗体结果符合率比较

2.3 两种方法判读抗核抗体所得荧光核型分布比较

以目视判读抗核抗体荧光核型结果作为标准，将全自动判读系统的核型判读结果与之相比较，两种方法总体一致率为85.1%。不同荧光模式其一致率由高到低分别为核点型(100%)、着丝点型(93.8%)、均质型(91.7%)、核仁型(88.5%)、胞质型(84.6%)、颗粒型和混合型(均80.0%)。见表4。

表4 两种判读方法检测核型分布比较

2.4 两种方法滴度判读符合率分析

对于两种方法核型判读相同的标本，进一步分析其滴度判读的符合率，结果显示除混合型外，其余均有较高的符合率，不同荧光模式其符合率由高到低分别为核点型、核仁型、着丝点型、颗粒型、均质型、胞质型和混合型。见表5。

表5 两种方法中相同荧光核型的滴度判读符合率

3 讨论

自身免疫性疾病因自身免疫功能紊乱而产生针对正常组织器官的病理性抗体[7]，其中抗核抗体在其诊断以及预后中有重要意义，且研究发现抗核抗体阳性可早于临床症状或部分特异性抗体5年[8]。但因抗核抗体检测方法多样，操作人员工作条件、技术水平、结果判读缺乏标准等各种原因，抗核抗体检测尚不规范[9]。

本实验结果表明，EUROPattern全自动荧光判读系统显示了高度准确的抗核抗体判读结果。两种方法在所有研究对象中阳性率分别为85.6%和86.1%，在自身免疫病患者中的阳性率达97.2%和98.3%。全自动判读系统和目视判读方法判读抗核抗体结果的灵敏度、特异性、准确度均很高(均≥96%)，且都有较好的阳性预测值、阴性预测值，两种方法间均无显著性差异。

进一步比较两种方法对抗核抗体荧光核型阴性和阳性结果的符合率，可见两种检测方法的总体符合率为95.5%，在自身免疫病患者及健康对照者中符合率分别是95.4%和96.0%，两种方法一致性检验结果Kappa值为0.816。因此，全自动判读系统阴性和阳性判读结果可信度较高。国外已有文献报道，全自动荧光判读系统和传统目视判读方法在阴性和阳性结果的一致性可达99.4%[10-11]。

间接免疫荧光法测定抗核抗体的常见荧光模式分为3类，细胞核型：包括颗粒型、均质型、核仁型、着丝点型等；胞质型：包括胞质颗粒、线粒体、溶酶体等；有丝分裂型：纺锥体、中心体等[12]。本实验中全自动判读系统与目视判读方法的核型判读具较高一致率，其总体一致率为85.1%，不同荧光模式的一致率由高到低分别为核点型、着丝点型、核均质型、核仁型、胞质型、核颗粒型和混合型。本实验中，核点型因例数较少而得到100%的一致率。颗粒型和混合型的一致率最低，均为80.0%。分析发现，50例目视判读颗粒型的标本，全自动判读系统判读结果中颗粒型40例，混合型7例，分析其原因，可能是目视判读方法因多种荧光模式重叠或非特异荧光的存在而导致混合型判读为颗粒型[13]。

对于全自动荧光判读系统和目视判读方法核型判读结果相同的标本，进一步分析其滴度判读的符合率，实验结果显示除混合型外，其余核型均有较高的符合率，不同荧光模式其符合率由高到低分别为核点型、核仁型、着丝点型、颗粒型、均质型、胞质型和混合型。混合型本身因核型复杂而致判读困难，故符合率较低(66.7%)。混合型滴度不一致原因主要是目视判读滴度低于仪器判读滴度，部分标本目视判读阴性而仪器判读为低滴度，以及核型判读不一致。因此，就判读滴度而言，仪器判读优于目视判读。另外还可通过对标本进行稀释，使荧光遮蔽变得可见，从而使混合型得到准确的识别。

总体而言，全自动荧光判读系统对抗核抗体核型和滴度判读的结果与传统目视判读结果比较，显示出较高的灵敏度、特异性及符合率。且能有效减少因主观因素而致抗核抗体检测结果在实验室内、实验室间的不一致性，提高实验室间接免疫荧光法检测抗核抗体的工作效率，从而实现间接免疫荧光检测抗核抗体的自动化和标准化，更好地满足临床需求。