牡丹花粉口含片的制备工艺及抗氧化活性

李志，李琳，石晓峰，范彬

(1.甘肃省医学科学研究院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730030)

牡丹(Paeoniasuffrutcosa)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)牡丹组(Sect.Moutan)多年生落叶灌木，别名鹿韭，鼠姑[1]，是一种重要的观赏药用植物.牡丹在我国已有2000 多年的药用历史，始载于《神农本草经》，列为中品，在历版《中华人民共和国药典》中均有收载，具有清热凉血、活血化瘀的功能[2]，其花、籽、根、花粉、叶亦均有很高的食药价值和经济价值[3].牡丹花粉是牡丹花雄蕊上的孢子，其粗蛋白含量为38.85%，人体必须氨基酸总含量达130.6 mg/g[4]；含18种脂肪酸，不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的50.45%～73.55%[5]；还含有水溶性糖、半纤维素、果胶、维生素、微量元素以及其他天然活性物质，包括酶、黄酮类化合物、激素、核酸和有机酸等[6-8].目前，牡丹花粉已被开发成口服液[9]，以及作为保健面条、酸奶、啤酒等的原料[10-12]，但迄今未见相关产品上市，究其原因可能是牡丹花粉尚未列入新食品资源.为了牡丹花粉的开发利用，本研究在牡丹花粉新食品资源研究申报的同时，以破壁的牡丹花粉为原料，采用湿法制粒压片，通过考察口含片的外观、口感、硬度、崩解时限，确定牡丹花粉口含片的最佳处方和制备工艺，并通过测定其模拟体内消化产物对DPPH·和ABTS·的清除能力，评价牡丹花粉口含片的抗氧化能力，以期为牡丹花粉的开发利用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器与设备 LWF6-TBI低温细胞壁破壁超微粉粹机(济南龙威制药设备有限公司)；YK160 摇摆式颗粒机(上海天祥健台制药机械有限公司)；TDP-1.5型单冲压片机(上海绿翊机械制造有限公司)；YD-20KZ片剂硬度仪(天大天发科技有限公司)；ZB-ID智能崩解仪(天河医疗仪器有限公司)；AE260 型万分之一电子天平(瑞士Mettle Toledo公司)；UV-1800型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);SHZ-82恒温震荡器(常州国华电器公司).

1.1.2 材料与试剂 牡丹花粉于2015年5月采自兰州新区中川牡丹园，其原植物经兰州牡丹园艺开发公司赵潜龙高级工程师鉴定为Paeoniarockii(S.G.Haw et L.A.Lauener)T.Hong et J.J.Li.

甘露醇(青岛明月海藻集团有限公司)；乳糖(镇江市富康生物工程有限公司)；阿斯巴甜(江苏汉光甜味剂有限公司)；柠檬酸(西安化学试剂厂)；硬脂酸镁(安徽山河药用辅料有限公司)；DPPH·、ABTS·以及胆酸钠均购自美国Sigma公司，抗坏血酸(国药集团化学试剂有限公司)；α-淀粉酶(天津市大茂化学试剂厂)；胃蛋白酶()；胰蛋白酶(上海中秦化学试剂有限公司)；95%乙醇(宁波万隆食用酒精有限公司)；其它试剂均为分析纯.

1.2 研究方法

1.2.1 牡丹花粉的破壁

1.2.1.1 破壁率的测定 称取等量的破壁前后的牡丹花粉，分别加等量蒸馏水使成混悬液，搅拌均匀，制片，在电子显微镜下进行镜检，记录花粉总数和完整花粉数，按公式：破壁率(%)=花粉总数-完整花粉数/花粉总数×100%，计算牡丹花粉的破壁率.

1.2.1.2 牡丹花粉的破壁工艺 将牡丹花粉均匀铺在白色瓷盘上面，厚度不超过0.5 cm，盖上一块白布，置于日光充足地方晒干或低温烘干，直至花粉中水分降至5%以下，过120目筛除杂，得到精选的牡丹花粉；然后将其装入低温细胞壁破壁超微粉碎机料斗中，启动仪器粉碎20～25 min，取出，辐照灭菌，测定其破壁率，即得破壁牡丹花粉成品.

1.2.2 单因素试验 依据湿法制粒的特点和药物的性质，参考文献方法[13-15]，选取多种药用辅料的不同配比进行制粒和压片，根据试验结果，选择甘露醇-乳糖为填充剂，阿斯巴甜-柠檬酸为矫味剂，乙醇为润湿剂，硬脂酸镁为润滑剂，以口含片的外观、口感、硬度、崩解时限为考察指标，进行单因素试验筛选原辅料的配比.

1.2.2.1 评价指标 将6片口含片放置灯光下以肉眼进行外观观察，根据口含片表面的光洁程度和色泽给予评分；招募志愿者10名采用双盲法口尝，根据口感酸甜程度给予评分；取6片口含片，利用片剂硬度仪测定硬度，取其平均值，按硬度值的大小范围给予评分；根据2015版中国药典四部通则[0921]项下崩解时限检查法，取6片口含片置于吊篮中，调节水温为(37±1) ℃，启动崩解仪并记录含片完全崩解的时间，取其平均值，按崩解时限的大小范围给予评分.具体指标及评分标准见表1.

表1 牡丹花粉口含片的评分标准

每个指标最高分值为9分，总分36分.

1.2.2.2 牡丹花粉口含片的制备 称取适量过80 目筛的牡丹花粉、甘露醇-乳糖和阿斯巴甜-柠檬酸，花粉+辅料=100%，混合均匀后，加入一定质量浓度的乙醇，经湿法制软材，过18目筛，制得颗粒，于50 ℃烘干后，经30 目筛整粒，制成干颗粒，加入适量的硬脂酸镁，混合均匀，压片，即得.

1.2.2.3 花粉用量的考察 固定阿斯巴甜-柠檬酸(1∶1)的用量为13%，考察花粉的用量，甘露醇-乳糖(1∶2)的用量随牡丹花粉用量(34%、30%、26%、22%、18%)的变化而变化，原辅料混合均匀后，按“1.2.2.2”项下操作，以70%乙醇为润湿剂、1%硬脂酸镁为润滑剂，制得牡丹花粉口含片，对其外观、口感、硬度、崩解时限进行评价.

1.2.2.4 填充剂甘露醇-乳糖比例的考察 固定花粉用量为22%、阿斯巴甜-柠檬酸(1∶1)的用量为13%，对用量为65%的甘露醇-乳糖的配比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)进行筛选，原辅料混合均匀后，按“1.2.2.2”项下操作，以70%乙醇为润湿剂、2%硬脂酸镁为润滑剂，制得牡丹花粉口含片，对其外观、口感、硬度、崩解时限进行评价.

1.2.2.5 矫味剂阿斯巴甜-柠檬酸用量的考察 固定花粉用量22%，考察矫味剂的用量，矫味剂甘露醇-乳糖(1∶2)用量随阿斯巴甜-柠檬酸(1∶1)的用量(5%、7%、9%、11%、13%)的变化而变化，原辅料混合均匀后，按“1.2.2.2”项下操作，以70%乙醇为润湿剂、2%硬脂酸镁为润滑剂，制得牡丹花粉口含片，对其外观、口感、硬度、崩解时限进行评价.

1.2.2.6 矫味剂阿斯巴甜-柠檬酸比例的考察 固定花粉用量为22%、甘露醇-乳糖(1∶2)的用量为67%，对用量为11%的阿斯巴甜-柠檬酸的比例(2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)进行筛选，原辅料混合均匀后，按“1.2.2.2”项下操作，以70%乙醇为润湿剂、2%硬脂酸镁为润滑剂，制得牡丹花粉口含片，对其外观、口感、硬度、崩解时限进行评价.

1.2.2.7 润湿剂乙醇浓度的考察 固定花粉用量为22%、甘露醇-乳糖(1∶2)的用量为67%、阿斯巴甜-柠檬酸(1∶2)的用量为11%，原辅料混合均匀后，加入不同质量浓度的乙醇(65%、70%、75%、80%、85%)，经湿法制软材，按“1.2.2.2”操作制得牡丹花粉口含片，对其外观、口感、硬度、崩解时限进行评价.

1.2.2.8 润滑剂硬脂酸镁用量的考察 固定花粉用量为22%、甘露醇-乳糖(1∶2)的用量为67%、阿斯巴甜-柠檬酸(1∶2)的用量为11%，原辅料混合均匀后，加入70%乙醇经湿法制软材，按“1.2.2.2”操作制得干颗粒，加入不同比例(1%、1.5%、2%、2.5%、3%)的硬脂酸镁，混合均匀，测定休止角，压片，对其外观进行评价.

1.2.3 正交试验 在单因素试验的结果上，采用正交试验L9(34)设计，对影响制剂品质的花粉用量、矫味剂比例和影响制粒质量的乙醇浓度进行优选，评价指标参照文献[16]设置的“权重系数”，按公式：综合总分=外观评分×0.2+口感评分×0.3+硬度评分×0.2+崩解时限评分×0.3进行计算.

1.2.4 验证试验 按最佳处方配比和工艺制备3批口含片，对其外观、硬度、崩解时限和重量差异进行评价，验证工艺的合理性.

1.2.5 牡丹花粉口含片的抗氧化活性试验

1.2.5.1 模拟体内消化样品的制备 模拟唾液的配制[17]：分别称取0.238 g Na2HPO4、0.019 g KH2PO4以及0.8 g NaCl ，加纯净水溶解，用0.1 mol/L的盐酸溶液将pH值调至6.75，加入5 g α-淀粉酶混匀使溶液的酶活力达到200 U/mL，置于100 mL棕色容量瓶中定容，即得.

表2 因素水平表

模拟胃液的配制[18]：称取0.2 g NaCl用0.1 mol/L盐酸溶液溶解，并用纯净水将pH值调至1.2，加入0.32 g胃蛋白酶混匀使溶液的酶活力达到2 000 U/mL，即得.

模拟肠液的配制：称取1.36 g KH2PO4加纯净水溶解，并用0.1 mol U/mL NaOH溶液将pH值调至6.8，加入0.05 g胰蛋白酶和2.50 g胆酸钠混匀，使溶液的酶活力达到75 U/mL.

1.2.5.2 模拟人体消化的样品制备[19-20]取牡丹花粉口含片研钵研细，精密称定2 g，3 份，置于锥形瓶中，分别加入模拟唾液、模拟胃液和模拟肠液各25 mL，以封口膜封口，置于摇床上，在37 ℃、180 r/min条件下，模拟唾液样品孵育10 min、模拟胃液和模拟肠液各孵育2 h，然后分别置于沸水浴灭酶10 min，快速冷却，加入25 mL无水乙醇，离心15 min(4 000 r/min)，取上清液以纯净水定容至50 mL容量瓶中，即得模拟唾液、模拟胃液和模拟肠液各自的消化样品.

另精密称取牡丹花粉口含片粉末2 g，置于锥形瓶中，加入25 mL模拟唾液，以封口膜封口，置于摇床上，在37 ℃、180 r/min条件下孵育10 min后，用5 mol/L盐酸溶液将pH值迅速调至1.2，加入0.08 g胃蛋白酶，以同样条件继续孵育2 h后，用1 mol/L NaOH溶液将pH值迅速调至6.8，加入0.0125 g胰蛋白酶和0.625 g胆酸钠，以同样条件继续孵育2 h，消化完毕后，置于沸水浴中灭酶10 min，快速冷却，加入25 mL无水乙醇，离心15 min(4 000 r/min)，取上清液以纯净水定容至50 mL容量瓶中，即得累加消化样品.

1.2.5.3 抗氧化活性测定[21-23]将各模拟消化样品及对照品Vc溶液分别稀释成系列浓度2、4、6、8、10、12 mg/mL溶液，分别精密吸取上述系列浓度溶液各1 mL，分别置于10 mL比色管中，各加入0.2 mmol/L的DPPH·溶液2 mL，再加入纯净水2 mL，摇匀，室温避光反应30 min后，于517 nm处测定吸光度值A1，同时以无水乙醇为参比测定DPPH·空白溶液吸光度值A0，按公式DPPH·清除率(%)=(A0-A1)/A0×100% ，计算各消化样品的DPPH·清除率，以牡丹花粉口含片各模拟消化样品质量浓度(X，mg/mL)对DPPH·清除率(Y，%)进行回归，得线性回归方程、相关系数和IC50.

将各模拟消化样品及对照品VC溶液稀释成系列浓度0.1、1、2、3、4、5 mg/mL溶液.分别精密吸取上述系列浓度溶液各1 mL，分别置于10 mL比色管中，各加入ABTS工作液(将35 mol/L的ABTS溶液和25 mol/L的过硫酸钾溶液按2∶1的体积比混匀，用无水乙醇稀释至吸光度为0.6±0.1)3 mL，再加入纯净水1 mL，摇匀，室温避光反应30 min后，于734 nm处测定吸光度值A1，同时以水为参比测定ABTS·空白溶液吸光度值A0，按公式ABTS·清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%，计算各消化样品的ABTS·清除率，以牡丹花粉口含片各模拟消化样品质量浓度(X，mg/mL)对ABTS·清除率(Y，%)进行回归，得线性回归方程、相关系数和IC50.

2 结果与分析

2.1 牡丹花粉的破壁率

牡丹花粉近低温细胞壁破壁超微粉碎机破壁后，其破壁率>97%.

2.2 单因素试验

2.2.1 花粉用量对牡丹花粉口含片质量的影响 由图1可见，当花粉的用量为22%时，口含片外观表面光滑、色泽均匀，硬度适中，崩解时限最优，故暂定牡丹花粉口含片的花粉用量为22%.

图1 花粉用量对牡丹花粉口含片质量的影响Figure 1 Effect of pollen dosage on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.2 甘露醇-乳糖的比例对牡丹花粉口含片质量的影响 由图2可见，随着乳糖比例的逐渐增大，牡丹花粉口含片的硬度和崩解时限明显增大，当甘露醇-乳糖比例为1∶2时，牡丹花粉口含片的外观、口感最佳，硬度和崩解时限符合药典要求，故将填充剂甘露醇-乳糖的比例定为1∶2.

图2 甘露醇-乳糖比例对牡丹花粉口含片质量的影响Figure 2 Effect of mannitol-lactose proportion on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.3 矫味剂用量对牡丹花粉口含片质量的影响 由图3可见，随矫味剂阿斯巴甜-柠檬酸用量的增大，牡丹花粉口含片的各项指标均增大，当矫味剂用量为11%和13%时，其口含片的外观均表面光滑、色泽均匀，虽然矫味剂用量为13%时口含片的硬度和崩解时限最优，当考虑到矫味剂用量为11%时口含片的口感最佳，故暂定矫味剂用量为11%.

图3 矫味剂用量对牡丹花粉口含片质量的影响Figure 3 Effect of corrigent dosage on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.4 阿斯巴甜-柠檬酸的比例对牡丹花粉口含片质量的影响 由图4可见，当阿斯巴甜-柠檬酸的比例为1∶1～1∶3时，牡丹花粉口含片的外观均表面光滑、色泽均匀，硬度相当，当阿斯巴甜-柠檬酸比例为1∶2时，牡丹花粉口含片口感最佳、崩解时限最优，故确定矫味剂阿斯巴甜-柠檬酸的比例为1∶2.

图4 矫味剂比例对牡丹花粉口含片质量的影响Figure 4 Effect of aspartame-citric acid proportion on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.5 乙醇浓度对牡丹花粉口含片质量的影响 由图5可见，当乙醇浓度为65%～75%时，牡丹花粉口含片的外观、硬度均较佳，以70%乙醇的崩解时限最优；当乙醇浓度超过75%时，牡丹花口含片的硬度下降出现松片裂片现象.综合考虑选择70%乙醇为润湿剂.

图5 乙醇浓度对牡丹花粉口含片质量的影响Figure 5 Effect of ethanol concentration on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.6 硬脂酸镁对颗粒流动性和压片效果的影响 由表3可见，当硬脂酸镁用量为1.5%时颗粒的流动性和口含片的外观最好，故确定硬脂酸镁用量为1.5%.

2.3 正交试验

正交试验结果见表4，方差分析结果见表5.由正交实验的结果可知，影响牡丹花粉口含片综合评分的因素依次为：A>B>C，即花粉用量>矫味剂比例>润湿剂；方差分析结果表明，花粉用量和矫味剂比例对牡丹花粉口含片质量的影响具有显著性意义(P<0.05)；最优水平组合为A3B2C2，即花粉用量为22%，矫味剂比例为1∶1.5，润湿剂为70%乙醇.

表3 硬脂酸镁对颗粒流动性和可压性的影响

表4 正交试验结果

表5 方差分析结果

F0.05(2,2)=19.000.

2.4 验证试验

根据单因素试验和正交试验优选得到的处方和工艺为牡丹花粉22%、甘露醇-乳糖(1∶2)67%、阿斯巴甜-柠檬酸(1∶1.5) 11%，混合均匀，用70% 乙醇湿法制粒，烘干，整粒，加入1.5% 硬脂酸镁，压片，即得.按上述最佳处方配比和工艺制备了3批口含片进行验证，观察到口含片外表光洁、色泽均匀；3批牡丹花粉口含片的硬度控制在37.8～48.3 N，崩解时限为11.30 min左右，平均片质量为0.400 6 g，质量差异小于±5%，结果见表6.以上结果均符合药典规定.表明优选的处方及工艺稳定可靠，合理可行.

表6 验证试验结果

2.5 牡丹花粉口含片的抗氧化活性

2.5.1 模拟消化样品清除DPPH·的能力 由图6可见，牡丹花粉口含片各模拟消化样品均表现出一定的清除DPPH·的活性.由表7可知，各模拟消化样品在质量浓度2～12 mg/mL范围内与DPPH·的清除率呈良好的线性关系，相关系数在0.966 7～0.995 5；牡丹花粉口含片不同消化样品对DPPH·的IC50依次为肠液消化样品>唾液消化样品>胃液消化样品，提示抗DPPH·活性成分主要在肠液和唾液消化，其累加消化样品对DPPH·清除率的IC50为(4.722±0.112)mg/mL.

2.5.2 模拟消化产物清除ABTS·的能力 由图7可见，牡丹花粉口含片各模拟消化样品均表现出一定的清除ABTS·活性.由表8可知，各模拟消化样品在质量浓度0.1～3 mg/mL范围内与ABTS·清除率呈良好的线性关系，相关系数在0.984 4～0.989 7；牡丹花粉口含片不同消化样品对ABTS·的的半数清除率率IC50依次为胃液消化样品>肠液消化样品>唾液消化样品，提示抗ABTS·活性成分主要在胃液消化，其累加消化样品对DPPH自由基清除率的IC50为(0.540±0.048) mg/mL.

表7 模拟消化样品对DPPH自由基的清除率的回归方程、相关系数和半数清除率

表8 模拟消化样品对ABTS自由基的清除率的回归方程、相关系数和半数清除率

图6 模拟消化样品及VC对DPPH自由基的清除能力Figure 6 DPPH free radical scavenging activity of simulation digestion samples and VC

图7 模拟消化样品及VC对ABTS自由基的清除能力Figure 7 ABTS free radical scavenging activity of simulation digestion samples and VC

3 结论

1) 本试验通过单因素和正交试验确定的牡丹花粉口含片的最佳处方和制备工艺为牡丹花粉用量22%，甘露醇-乳糖(1∶2)用量为67%，阿斯巴甜-柠檬酸(1∶1.5)用量为11%，原辅料混合均匀，加入70%乙醇经湿法制软材，过18目筛，制得颗粒，于50 ℃烘干后，经30 目筛整粒，制成干颗粒，加入1.5%硬脂酸镁，混合均匀，压片.该工艺经验证，制得的口含片均符合药典标准，表明该工艺稳定可行，操作简便，适合于工业化生产.

2) 本试验通过测定牡丹花粉口含片模拟体内消化产物对DPPH和ABTS自由基的清除能力，评价牡丹花粉口含片抗氧化活性.结果显示，肠液消化样品对DPPH自由基的清除能力较强，而胃液消化样品对ABTS自由基的清除能力较强，累加消化液对DPPH、ABTS自由基的半数清除率(IC50)分别为(4.722±0.112)(0.540±0.048) mg/mL.