有机酸改性对玉米醇溶蛋白膜机械性能的影响

王 键 何余堂 尹天罡 解玉梅 刘 贺

（渤海大学食品科学与工程学院 国家鱼糜及鱼糜制品加工技术研发分中心生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心 辽宁锦州 121013）

目前，塑料包装因难回收、难降解等而造成的环境污染问题日益严重。随着现代环保生活理念的日益普及，推动了对可生物降解包装材料的需求。为制备良好的生物降解性材料，一方面，将一些生物降解剂和添加剂添加到合成塑料基质中，使其在自然环境中不稳定且易于降解[1-3]；另一方面，将某些具有成膜性能的生物聚合物作为天然包装及食品保鲜材料。其中，某些多糖和蛋白质已被证明是理想的包装材料，其中一些已被商业应用[4-7]。在潜在的天然包装及食品保鲜材料中，玉米醇溶蛋白是一种值得研究的理想材料[8-10]。美国FDA 还将其列为最安全的生物材料赋形剂之一[11]。

玉米醇溶蛋白具有特殊的氨基酸组成，其含有必需氨基酸较少，营养价值低[12]，然而其成膜性极佳，无需添加任何塑化剂、鞣制剂就可以在常温下形成阻湿、阻氧、耐油、抗辐射的蛋白膜[13]，在特种食品保鲜、包装及制药行业具有很强的应用潜质。玉米醇溶蛋白膜在现实生活中应用的瓶颈是其较差的机械性能，这也是植物蛋白膜共同的缺点。

玉米醇溶蛋白成膜的作用力是蛋白间疏水键、氢键和有限的二硫键。添加塑化剂，如甘油可改善玉米醇溶蛋白膜的机械性能，而在存放过程中，玉米醇溶蛋白分子矩阵中的甘油会慢慢迁移至表面导致塑化效果失效。对玉米醇溶蛋白改性也许是解决玉米醇溶蛋白膜机械性能问题的有效手段。化学改性是用化学方法使蛋白质分子中的氨基酸残基的侧链基团或多肽链发生断裂、聚合或引入新的基团来改变蛋白质功能性质的方法，包括磷酸化、酰化、去酰氨、共价交联、糖基化等多种改性方式[14-16]。这些方法可以改善玉米醇溶蛋白膜的一些性质，然而，其机械性能差的缺点却无法解决。由于柠檬酸可对玉米醇溶蛋白膜机械性能产生较大影响[17]，因此选用了与之结构相近的乙酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸共6 种有机羧酸，研究其对玉米醇溶蛋白膜的影响。这些羧酸不仅在水和乙醇中均有良好的溶解度，而且是食品工业中常用的添加剂。使用这些添加剂对玉米醇溶蛋白改性，保障了其食用的安全性。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

鲜玉米，垦粘4 号（籽粒黄色），产地为辽宁省锦州；复合生物保鲜剂由本课题组研制。

柠檬酸（AR），天津市致远化学试剂有限公司；蔗糖酯，杭州瑞霖化工有限公司；其它试剂，天津市化学试剂一厂。玉米醇溶蛋白，自制；琥珀酸（AR），美国阿拉丁工业公司；苹果酸（AR），天津市福晨化学试剂厂；酒石酸（AR），上海翰思化工有限公司；乳酸（AR）、冰乙酸（AR）、无水乙醇（AR）、氢氧化钠（AR），天津市风船化学试剂科技有限公司。

恒温水浴锅（HH-4 型），鄄城威瑞科技仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9075A），上海一恒科学仪器有限公司；质构仪（TA.XT plus型），北京超技仪器有限公司；真空冷冻干燥机（ALPHA 1-2LD PLUS 型），宁波海曙恒隆试验器材有限公司；场发射扫描电镜（S-4800 型），日本株式会社日立制作所。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白的制备 将玉米蛋白粉用粉碎机粉碎研磨成细小颗粒，过70 目筛得到均匀的玉米蛋白粉，取80 g 玉米蛋白粉于烧杯中并按一定料液比加入乙醇水溶液，混合均匀后用0.4 g/mL NaOH 溶液调节溶液pH 值。将调好pH 值的玉米蛋白粉溶液放入超声发生器中超声提取，待提取完毕后将溶液以4 000 r/min 转速离心15 min。取上层清液，并加入等体积的0.01 g/mL NaCl 溶液置入4 ℃冰箱静置12 h 得湿玉米醇溶蛋白沉淀，取出沉淀反复清洗至中性。最后将沉淀物放入干燥箱40 ℃干燥至恒重取出，研磨过60目筛，即可得到产物玉米醇溶蛋白[18]。

1.2.2 有机酸改性玉米醇溶蛋白膜的制备 量取10 mL 乙醇溶液置于烧杯中，加入改性剂有机酸，经磁力搅拌充分混匀，再称取1 g 玉米醇溶蛋白，在磁力搅拌下慢慢加入玉米醇溶蛋白粉使其充分分散溶解，最终形成0.1 g/mL 浓度的玉米醇溶蛋白溶液。慢慢将玉米醇溶蛋白膜溶液倾倒于不锈钢板上，再用涂膜器将膜液均匀涂膜以尽量确保成膜后的玉米醇溶蛋白膜厚度一致，将附有膜液不锈钢板置于室温中干燥平衡12 h 即可制得改性膜。

碱催化有机羧酸改性玉米醇溶蛋白膜的制备，是在有机酸改性玉米醇溶蛋白膜液制备后，加入研磨成粉的氢氧化钠颗粒，调整pH 值并加热至60 ℃保温30 min，待反应完成后，将膜液倾倒于不锈钢板上干燥成改性膜。

1.2.3 玉米醇溶蛋白膜机械性能测定 用于玉米醇溶蛋白膜机械性能测定的样品，需先将膜置于常温50%相对湿度的生化培养箱中平衡24 h 以上。裁剪膜为长度60 mm，宽度10 mm 的长条状样品，质构仪的参数设定为初始夹具间距30 mm，机头抬升速度60 mm/min，待样品夹好运行测试程序，记录膜样品拉断时所受力（N）与断裂长度（mm），厚度用螺旋测微器测出。

样品的抗拉强度[19]（TS）由以下公式计算得出：

式中，Fmax——膜样品拉断时所受力，N；W——膜样品的宽度，mm；T——膜样品的厚度，mm。

样品的延展率（E）由以下公式计算得出：

式中，L0——膜样品的初始长度，mm；L——膜样品在拉断时的长度，mm。每个样品重复5 次。

2 结果与分析

2.1 制备条件对玉米醇溶蛋白膜机械性能影响

2.1.1 乙醇体积分数 如图1 所示，乙醇体积分数对玉米醇溶蛋白膜机械性能影响较小，乙醇体积分数为90%时，膜的机械性能处在均衡水平，所成膜的各项指标较好，膜外观平整透明，无不溶物，完整度高。随着乙醇体积分数的升高膜的抗拉强度略有上升，这可能是由于在较高的体积分数下，玉米醇溶蛋白分子中疏水氨基酸残基暴露程度增大，疏水相互作用增强，分子间聚集结合程度高，使得其抗拉强度增加，然而，乙醇体积分数对于抗拉强度总体上来说影响不大。膜的延展率则在一定程度上表现出了无序性且普遍误差较大。

2.1.2 无碱改性羧酸添加量 无碱改性共有6 种羧酸，选用柠檬酸作为测试羧酸添加量的试剂是由于在预试验中，柠檬酸对玉米醇溶蛋白膜的性质改变温和，效果较好。

图1 乙醇体积分数对玉米醇溶蛋白膜机械性能影响Fig.1 Effects of ethyl concentration on zein film mechanical property

如图2 所示，柠檬酸对玉米醇溶蛋白膜的机械性能影响明显，考虑到柠檬酸添加量在超过4%时，黏性增加不利于制膜，因此选择柠檬酸最佳添加量为3%做后续试验。随着柠檬酸添加量的增加，玉米醇溶蛋白膜的机械性能呈平稳下降趋势，其延展率却显著提高，这表明柠檬酸在膜体系中起到了塑化剂的作用。

图2 柠檬酸添加量对玉米醇溶蛋白膜机械性能影响Fig.2 Effects of CA concentration on zein film mechanical property

2.1.3 加碱催化改性溶液的pH 值 由于6 种羧酸酸性不同，不易统一固体NaOH 添加量，因此使用溶液的pH 值来反应NaOH 的添加量，其值是整个反应过程的关键因素。

如图3 所示，在膜液pH 值为5.0 时，玉米醇溶蛋白改性膜的抗拉强度达到最大，然而其膜的延展率下降严重，考虑到碱催化改性膜的抗拉强度是重要指标，因此选用最佳pH 值为5。在膜液pH 值较低的反应初期，玉米醇溶蛋白膜的抗拉强度显著增加，而随着膜液pH 值的增加，膜的抗拉强度反而下降，这可能是由于玉米醇溶蛋白氨基酸残基与柠檬酸之间交联过度，适度的交联可以增强玉米醇溶蛋白分子间的作用力，使膜的强度提升，随着反应程度增加，玉米醇溶蛋白原有结构被破坏，大分子物质形成，分子间作用力下降，导致玉米醇溶蛋白膜的抗拉强度下降，所以需要控制交联反应程度。膜液pH 值也对玉米醇溶蛋白膜的延展率影响显著，随着膜液pH 值的生高，膜的延展率快速下降，在膜液pH 值为4.0 时已达到较低水平。说明交联反应可在分子间产生作用力较强的共价键，降低了分子的流动性，使得膜的延展率大幅下降。

2.2 羧酸种类对玉米醇溶蛋白膜机械性能的影响

在玉米醇溶蛋白含量0.1 g/mL，乙醇体积分数90%，羧酸添加量0.03 g/mL，加碱改性溶液pH值调整至5.0，反应温度60 ℃，反应时间30 min 的条件下，6 种羧酸对玉米醇溶蛋白改性具体结果见表1。

由表1 可知改性对于玉米醇溶蛋白膜的厚度影响不显著，说明改性并未使玉米醇溶蛋白膜厚度显著增加。无碱催化下，改性膜抗拉强度：冰乙酸＞对照组＞琥珀酸＞酒石酸＞柠檬酸＞乳酸＞苹果酸，延展率：苹果酸＞柠檬酸＞乳酸＞琥珀酸＞酒石酸＞冰乙酸＞对照组。苹果酸对于玉米醇溶蛋白膜的延展率最大，达到（228.17±26.53）%，相较于对照组显著提升，然而也造成了膜的刚性应力丢失，其抗拉强度仅为（0.70±0.05）MPa。柠檬酸改性膜延展率提升至（137.86±19.72）%且保持了（4.65±0.18）MPa 的抗拉强度，综合性能最佳。碱催化改性下，改性膜抗拉强度：柠檬酸＞酒石酸＞琥珀酸＞乳酸＞冰乙酸＞对照组＞苹果酸，延展率则与对照组无显著差异。碱催化柠檬酸改性使膜抗拉强度增加至（12.73±1.05）MPa，得到了强度很高的膜，然而其延展率不理想，仅为（3.65±0.21）%。

图3 反应pH 值对玉米醇溶蛋白膜机械性能影响Fig.3 Effects of pH on zein film mechanical property

表1 不同羧酸对膜机械性能的影响Table 1 Effects of different carboxylic acids on the mechanical property of zein film

2.3 羧酸种类对玉米醇溶蛋白膜改性机理推测

在玉米醇溶蛋白含量0.1 g/mL，乙醇体积分数90%，羧酸添加量0.03 g/mL，加碱改性溶液pH 值调整至5.0，反应温度60 ℃，反应时间30 min 的条件下，6 种羧酸对玉米醇溶蛋白改性具体结果见图4。

图4 6 种羧酸结构Fig.4 The structure of six carboxylic acids

结合表1 结果，无碱羧酸改性条件下，使玉米醇溶蛋白膜柔性增加的羧酸有一个共同点：只含有一个羟基基团，显然是羟基基团与水分子、玉米醇溶蛋白分子之间的氢键作用使膜分子流动性增强，体系自由体积增加，然而，酒石酸含有两个羟基基团，却没有显著的增加玉米醇溶蛋白膜的延展率，可能是由于两个羟基基团会导致酒石酸分子间形成氢键，而导致了与玉米醇溶蛋白氨基酸残基无法氢键连接。

加碱反应可能发生了交联反应，然而，反应原理应与酰化反应不同，其交联机理如图5 所示。

图5 羧酸与玉米醇溶蛋白交联机理[20]Fig.5 Carboxylic acid and zein crosslinking mechanism[20]

通过上述反应，柠檬酸将两个蛋白分子交联在一起，发生此反应要求羧酸至少需要含有两个羧基基团，表中数据也证实了这一观点，一元酸乳酸和冰乙酸对玉米醇溶蛋白膜的抗拉强度在碱催化反应下没有提升，表明乳酸和冰乙酸未与玉米醇溶蛋白分子交联反应。二元酸在碱催化下与玉米醇溶蛋白发生交联反应，使蛋白膜的抗拉强度提升。二元酸中苹果酸是特例，其与玉米醇溶蛋白的交联没有提升膜的抗拉强度，这可能是由于反应前，苹果酸使玉米醇溶蛋白膜抗拉强度降低到了一个较低的程度，随着反应发生，改性膜的抗拉强度虽由0.70 MPa 上升至4.02 MPa，然而已无法恢复到原有水平。交联反应的发生导致了分子流动性变差，膜的延展率均显著降低。由于控制了反应进程，交联的程度较小，没有大分子质量物质形成，对膜的结构变化只在于微观量上，膜厚度增加不明显。

3 结论

通过对玉米醇溶蛋白改性膜的制备条件试验，最佳的有机酸无碱改性玉米醇溶蛋白膜制备条件为玉米醇溶蛋白含量0.1 g/mL，乙醇体积分数90%，羧酸添加量0.03 g/mL。碱催化有机酸改性玉米醇溶蛋白膜制备条件为在玉米醇溶蛋白含量0.1 g/mL，乙醇体积分数90%，羧酸添加量0.03 g/mL，加碱改性溶液pH 值调整至5.0，反应温度60 ℃，反应时间30 min。在此条件下所制玉米醇溶蛋白膜平坦易揭，完整性好，综合机械性能佳。

在不同有机酸改性时，苹果酸对于玉米醇溶蛋白膜的延展率最大，达到（228.17±26.53）%，而其抗拉强度仅为（0.70±0.05）MPa。柠檬酸改性膜延展率提升至（137.86±19.72）%且保持了（4.65±0.18）MPa 的抗拉强度，综合性能最佳。碱催化改性下，碱催化柠檬酸改性使膜抗拉强度增加至（12.73±1.05）MPa，得到了强度很高的膜，然而其延展率不理想，仅（3.65±0.21）%。通过对有机酸结构的分析，猜测其改性机理为：具有1 个羟基基团的羧酸可与膜体系形成氢键，使得膜分子流动性增强，提高膜的延展率；具有2 个以上羧基基团的羧酸，在碱的催化下可与玉米醇溶蛋白氨基酸残基发生交联反应，使膜的抗拉强度提升。