扫频超声处理时间对β-乳球蛋白酶解制备多肽抗氧化活性的影响

梁秋芳 张 熙 任晓锋，2* 侯 婷 瞿志超 冯 洛 马海乐，2

（1 江苏大学食品与生物工程学院 江苏镇江212013 2 江苏大学食品物理加工研究院 江苏镇江 212013）

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，简称β-LG）主要是由反刍动物乳腺细胞分泌的一种球状蛋白，是牛乳清中最为丰富的蛋白质，其含量占50%左右[1]。β-LG 除了为机体提供营养物质外，近年来研究发现以β-LG 为原料酶解得到的多肽具有多种生物功能活性，如抗氧化[2]，降血压[3]，抗炎[4]和抑菌[5]等。然而，β-LG 具 有两个二硫键（Cys66-Cys160 和Cys106-Cys199）和一个自由巯基（Cys121）[6]。当β-LG 在加热或者酶解（尤其是酶解环境的pH 值为2 或者8）的过程中，分子间的二硫键能够维持分子的大分子结构，甚至使得蛋白发生聚集，从而导致蛋白的酶解效率低，活性多肽很难释放。目前，用于改善β-LG 酶解效率的方法有化学修饰、高压、微波、加热等[7]。

超声波技术作为一种新型的物理加工技术，因无污染，操作简单及易控制等优点被广泛应用于食品物理加工中。由于其独特的声空化、机械效应及热效应[8]，因此超声波可以改变蛋白的分子结构，增加传热传质，提高大分子蛋白与酶的接触频率，从而改善蛋白的酶解，提高酶解产物的功能活性[9]。例如，Wang 等[10]研究了超声处理使大豆蛋白的7S 和11S 球蛋白暴露，大豆蛋白酶解多肽的抗氧化活性提高。Jing 等[11]研究发现在超声预处理条件：超声功率150 W，超声时间20 min，超声温度50 ℃下，核桃蛋白多肽的DPPH 自由基清除率显著提高。然而，目前对于超声波处理β-LG，酶解制备抗氧化活性多肽的研究非常有限。

本研究中采用扫频超声波预处理β-LG，碱性蛋白酶酶解制备抗氧化活性肽，研究不同的超声预处理时间（10，20，30，60，90 min）对β-LG 的表观结构影响，超声波对酶解产物的抗氧化活性及氨基酸组成、分子质量分布和疏水性的影响，为超声辅助β-LG 酶解制备抗氧化活性肽提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

乳清蛋白粉，西安裕华生物科技有限公司；碱性蛋白酶Alcalase 2.4L FG（228 000 U/g），诺维信生物技术有限公司；1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl（DPPH）自由基、2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）（ABTS）自由基，美国Sigma 公司；FeCl2·4H2O，上海沃凯Ourchem 化学试剂有限公司；MD75（12 000～14 000 u）透析袋，苏州达麦迪生物医学科技有限公司；其余试剂均为分析纯级。

1.2 试验方法

1.2.1 β-LG 的提取 β-LG 的提取参照LEEB等[12]的方法并稍作修改。将乳清蛋白配成质量浓度为7 mg/100 mL 的均匀溶液，1∶1 加入质量浓度为7 mg/100 mL 的NaCl 溶液，0.5 mol/L 的HCl 调节溶液pH 值为2，静置30 min 后，5 000 r/min 离心20 min，取上清液，4 ℃透析20 h，收集透析袋中的溶液，浓缩冷冻干燥即得β-LG。

1.2.2 β-LG 的扫频超声波处理 本研究所使用的扫频超声波设备由江苏大学马海乐团队自主研制。超声的扫频频率指超声的频率围绕中心频率在一个范围内以一定周期上下波动[13]，用（fi±δ）kHz表示（fi为中心频率，δ 为上下波动幅度）。200 mL质量浓度为3 mg/mL 的β-LG 密封于超声袋中，水的体积为5.4 L（30 cm×36 cm×5 cm）进行超声。超声条件：超声频率fi为40 kHz；频率周期δ 为2 kHz；超声功率为600 W；扫频周期为500 s；间歇比为10∶3。超声时间为10，20，30，60，90 min。超声处理后的样品一部分旋转蒸发，冷冻干燥，一部分用于后期的酶解。

1.2.3 β-LG 的酶解 取超声后的β-LG 溶液，水浴锅预热至50 ℃，0.5 mol/L NaOH 调节溶液pH值至9，加入碱性蛋白酶（17 μL 酶/g 蛋白），酶解40 min，酶解过程中使用0.1 mol/L NaOH 对溶液进行滴定，使溶液pH 值维持在9。酶解结束后，沸水浴灭酶10 min，调节溶液pH 值至7，冷却离心，取上清液，浓缩、冷冻干燥。

1.2.4 酶解产物的抗氧化活性

1.2.4.1 DPPH·自由基清除率 2 mL×1 mg/mL 样品（β-乳球蛋白酶解物）与2 mL×0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液振荡混匀，在37 ℃下避光反应30 min，后于517 nm 处测量吸光度值，蒸馏水代替样品作空白。计算公式为：

式中，Ab——空白吸光度值；As——样品吸光度值。

1.2.4.2 ABTS 法 将7 mmol/L ABTS 储备液和2.45 mmol/L 高硫酸钾混合后，25 ℃下避光静置12～16 h，形成ABTS+·工作液；使用前用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）稀释，使工作液在734 mm处吸光值为0.70±0.02。将20 μL×1 mg/mL 样品与1 980 μL 的ABTS+·振荡混匀，30 ℃下避光反应10 min 后在波长734 nm 处测吸光度值。超纯水作为空白。用0～3 mmol/L Trolox 替代样品进行标准曲线的拟合。计算公式如下：

式中，Ab——空白吸光度值；As——样品吸光度值。

1.2.4.3 亚铁离子络合能力 取2 mL×1 mg/mL样品、0.05 mL×2 mmol/L 的FeCl2溶液和1.85 mL超纯水均匀混合，室温下避光反应3 min 后加入0.1 mL×5 mmol/L Ferrozine 溶液，30 ℃下避光反应30 min，在波长562 nm 处测定反应溶液的吸光度值，并以超纯水作为对照。计算公式为：

式中，Ab——空白吸光度值；As——样品吸光度值。

1.2.5 酶解产物的表面疏水性（H0）采用Kato等[14]的方法稍作修改，用于测定β-LG 和其酶解产物的H0。将β-LG 酶解液10 000×g 离心10 min 取上清液，稀释至质量浓度为1.0，0.8，0.6，0.4，0.2 mg/mL，溶剂为0.01 mol/L pH 7 的磷酸盐缓冲液。取4 mL 样品，加入8 mmol/L×20 μL ANS，充分混匀，25 ℃下避光反应15 min，于激发波长370 nm，发射波长470 nm 下测得样品荧光强度，并将荧光强度对蛋白浓度进行线性回归分析，斜率即为表面疏水性H0。

1.2.6 酶解产物的氨基酸组成 采用氨基酸分析仪测定酶解上清液中的氨基酸组成，将样品置于酸解管中，加入10 mL×6 mol/L HCl 真空封口，于110 ℃下酸解22 h，冷却后，过滤、定容，上机测定。采用15%的三氯乙酸沉淀酶解上清液中的多肽后，直接上机测定样品中游离氨基酸的含量。总氨基酸含量减去游离氨基酸的含量即得多肽中的氨基酸组成。

1.2.7 酶解产物的分子质量分布 采用高效液相尺寸排阻色谱法测定β-LG 酶解液分子质量分布。色谱柱：TSKgelG2000；流动相的组成：乙腈∶水∶三氟乙酸为45∶5∶0.1；检测波长：220 nm；洗脱流速：0.5 mL/min；进样量：10 μL；柱温为室温。采用软件Breeze（Waters，MA，USA）进行数据处理。采用以下标准品作标准曲线：牛血清白蛋白（67 000 u）、细胞色素C（12 500 u）、杆菌肽（1 450 u）、L-色氨酸（204 u）。多肽的保留时间与标准品分子质量对数之间的关系的建立参考Zhou 等[15]的方法。根据分子质量大小分成4 个区域：大于2 000 u，1 000～2 000 u，200～1 000 u，小于200 u，对各区域的色谱峰进行积分，相对峰面积即为样品各分子质量的相对含量。

1.2.8 平均粒径 β-LG 样品配制成1 mg/mL 的溶液后，立刻使用动态光散射粒径分析仪Malvern Nanosizer ZS（Malvern，Worcestershire，UK）测量其平均粒径，测量温度为25 ℃。

1.2.9 扫描电镜（SEM）用双面胶将超声处理与未超声的β-LG 粉末固定在样品台上，并喷上一层金属导电层，然后采用扫描电镜在15 kV 的加速电压下进行微观形态观察，放大倍数为5 000倍。

1.2.10 数据统计与分析 试验平行重复3 次，取平均值，试验数据使用SPSS Statistics 17.0 进行数据处理，单因素方差分析，采用多重比较的方法进行显著性分析，显著性水平P＜0.05 表示有显著性差异。使用Origin 8.0 绘图。

2 结果与分析

2.1 超声时间对β-LG 的平均粒径的影响

蛋白质的粒径大小间接反映了蛋白的空间结构变化，蛋白的聚集状态。图1 为不同超声时间的超声处理对β-乳球蛋白平均粒径的影响。

从图1 可以看出，超声处理时间显著影响β-LG 的粒径大小。10 min 的超声处理使得β-LG 的颗粒粒径增大，然而20 min 和30 min 的超声则使得蛋白粒径减小，且显著低于对照组。该结果表明短时间（10 min）的超声处理可能不会破坏蛋白质分子，只是诱导蛋白质分子的规则排序，导致不稳定聚集体的形成和粒径的增加。随着超声时间延长至20～30 min，粒径大大减小，并且明显低于对照组；这可能是因为上述不稳定的聚集体在剪切力、微喷射、冲击波等超声效应的作用下，以较小的蛋白质颗粒分散。当超声时间达到60～90 min时，粒径的变化与20～30 min 的超声处理结果相反，小颗粒蛋白重新聚集，其粒径达到604 nm（与对照组相比显著）。同样，Jiang 等[16]报道了超声处理（450 W，24 min）引起了黑豆分离蛋白形成聚集体。Arzeni 等[17]研究发现高强度的超声处理使得鸡蛋蛋白的粒径增加。β-LG 的聚集主要是由于超声引起的大分子蛋白的非共价相互作用的变化，如静电、氢键和疏水相互作用等驱动蛋白质发生聚集，导致蛋白颗粒粒径增大。

2.2 超声时间对β-LG 的疏水性的影响

蛋白质的表面疏水性（H0）可以表征蛋白分子表面暴露的疏水基团的数量，蛋白分子间的疏水相互作用对蛋白质的稳定性、分子构象和功能至关重要。图2 为不同超声时间的超声处理对β-乳球蛋白的表面疏水性的影响。

从图2 中可以看出，扫频超声处理后β-LG表面疏水性增加了1.80%～9.55%。说明超声作用于β-LG，使蛋白分子内埋的疏水残基暴露，酶切位点大量暴露，使得酶解后活性多肽大量释放，从而酶解液的抗氧化活性大幅度提高。长时间的超声后（60～90 min），β-LG 的表面疏水性有下降的趋势，可能是蛋白在疏水作用的驱动下相互靠近，蛋白分子发生聚集，使得已暴露的疏水基团重新包埋于蛋白分子内部，从而导致β-LG 疏水性下降。大量研究发现蛋白的疏水相互作用是蛋白质重折叠过程中出现聚合的主要原因[13，17]。

2.3 超声时间对β-LG 酶解产物的抗氧化活性的影响

图1 不同超声时间的超声处理对β-乳球蛋白的平均粒径的影响Fig.1 Effect of different ultrasound treatment time on the average particle size of β-lactoglobulin

人体在新陈代谢过程中产生各种各样的氧化中间产物，如羟基自由基、超氧阴离子、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等[18]。基于不同氧化机理的抗氧化能力检测方法也多种多样，本研究主要应用基于电子转移途经的DPPH 自由基清除法、ABTS 法和抑制自由基产生的Fe2+络合能力法来评价酶解产物的体外抗氧化能力。图3 为不同超声时间的超声预处理对β-乳球蛋白酶解产物抗氧化活性的影响。

图2 不同超声时间的超声处理对β-乳球蛋白的表面疏水性的影响Fig.2 Effect of different ultrasound treatment time on the surface hydrophobicity of β-lactoglobulin

从图3 可以看出，超声时间对β-LG 酶解产物的抗氧化活性具有显著性影响。与对照组相比，10～90 min 的超声处理使得酶解产物的DPPH·清除率显著提高了7.97%～30.28%（P＜0.05）。其中除了超声60 min，其它时间的超声处理的自由基清除率间没有显著差异。对于ABTS·清除能力，随着超声时间的延长，TEAC 值呈先增加后减少的趋势，其中超声处理20 min 后，β-LG 酶解产物的TEAC 最大，即ABTS·清除能力达到最强，与不超声相比增加了31.90%。体内过渡金属离子是自由基的另一重要来源，其通常含有未配对电子，可催化自由基的形成。对照组的Fe2+络合能力为71.96%，超声处理后，Fe2+络合率增加了7.53%～15.76%（P＜0.05）。其中30 min 的超声处理后，其Fe2+络合能力效果最佳，对比不超声处理增加了15.76%。综合3 个抗氧化的评价指标，随着超声时间的延长，其抗氧化活性逐渐增加；在超声处理时间为20～30 min 时，β-LG 酶解物的抗氧化活性最高；当超声时间延长到60～90 min 后，其抗氧化活性逐渐下降。

图3 不同超声时间的超声预处理对β-乳球蛋白酶解产物抗氧化活性的影响Fig.3 Effect of different ultrasound pretreatment time on the antioxidant activity of β-lactoglobulin hydrolysates

β-LG 酶解物的抗氧化活性取决于酶解产物的组成，如分子质量分布、氨基酸组成、疏水性；而不同时间超声预处理引起酶解产物的抗氧化活性的差异间接表明了超声引起了β-LG 的结构变化差异。因此，一方面研究者研究了不同时间超声预处理引起了酶解产物的分子质量分布、氨基酸组成、疏水性的变化；另一方面研究了不同超声时间引起的β-LG 结构变化。

2.4 超声时间对β-LG 酶解产物的疏水性的影响

酶解产物的疏水性（H0）由其疏水性氨基酸的比例、所处位置，以及所含多肽所形成的二级结构决定。大量研究表明酶解产物的H0与其抗氧化活性密切相关[19-20]。图4 为不同超声时间的超声预处理对β-乳球蛋白酶解产物的表面疏水性的影响。

如图4 所示，随着超声时间的延长，β-LG 酶解液的疏水性大幅度增加，在10 min 时达到最大，随后开始下降，在30 min 达到最低，随后开始上升。在所有超声时间下，其H0显著高于对照组。该结果表明扫频超声预处理有助于β-LG 酶释放出疏水性的氨基酸和多肽，从而提高了β-LG 的抗氧化活性。孙国威[21]研究发现多肽的抗氧化活性与其疏水性呈正相关，随着疏水性的增大，大豆肽的抗氧化活性也有一定程度的增加。Cheison 等[22]认为疏水性氨基酸越多，多肽的抗氧化活性越强；尤其是Cys、Trp、His、Pro、Tyr、Phe 以及Met 等疏水性氨基酸残基，能够促进多肽与生物体内脂质的结合，从而增强了酶解产物的抗氧化活性。

图4 不同超声时间的超声预处理对β-乳球蛋白酶解产物的表面疏水性的影响Fig.4 Effect of different ultrasound pretreatment time on the surface hydrophobicity of β-lactoglobulin hydrolysates

2.5 超声时间对β-LG 酶解产物的分子质量分布的影响

蛋白质酶解产物的分子质量分布与生物活性密切相关，研究发现较小分子质量多肽比大分子质量多肽具有更好的抗氧化活性，多肽的分子质量越小，则越容易被人体消化吸收，到达靶向部位发挥生物活性[23-24]。表1 为不同超声时间的超声预处理对β-乳球蛋白酶解产物分子质量分布的影响。

表1 不同超声时间对β-乳球蛋白酶解产物分子质量分布的影响Table 1 Effect of different ultrasound pretreatment time on the molecular weight distribution

从表1 可以看出，扫频超声处理大幅度改变了水解产物的分子质量分布。超声处理10～60 min 使得200～1 000 u 和1 000～2 000 u 的多肽组分含量分别增加了2.02%～4.37%，6.98～9.93%；大于2 000 u 多肽含量基本不变；而自由氨基酸的含量大幅度下降。以上结果表明，10～60 min 的扫频超声处理有利于分子质量在200～2 000 u 多肽的释放，从而提高了其酶解产物的抗氧化活性。小分子肽的释放表明，超声处理可能引起β-LG 结构的松散，蛋白内部的酶切位点大量外露，增加了碱性蛋白酶和酶解部位的接触几率。然而，超声处理90 min 后，200～1 000 u 和1 000～2 000 u 的多肽含量显著降低；对应的自由氨基酸含量则显著增加。可能由于超声时间达到90 min 时，引起了蛋白重新聚集形成大的聚集体（图1），碱性蛋白酶与蛋白酶解部位的接触几率减小，而这与β-LG酶解物的抗氧化活性的研究结果趋势一致；当超声时间延长到60～90 min 后，其抗氧化活性逐渐下降（图2）。Gao 等[25]使用中性酶水解棉籽蛋白后发现，分子质量在800～1 200 u 的组分抗氧化活性最强。Zhu 等[26]研究发现超声提高了面筋蛋白水解产物分子质量在500～3 000 u 的肽含量，并具有较强的抗氧化活性。

2.6 超声时间对β-LG 酶解产物中多肽氨基酸组成的影响

β-LG 酶解产物中自由氨基酸对于功能活性几乎没有贡献作用，而其中多肽的氨基酸组成决定了多肽的抗氧化活性。因此，研究超声对β-LG酶解产物中多肽氨基酸组成。表2 为不同超声时间的超声预处理对β-乳球蛋白酶解产物氨基酸组成的影响。

如表2 所示，扫频超声改变了酶解产物中多肽中氨基酸含量，尤其是对多肽的抗氧化活性具有较强贡献度的Leu、Tyr、Phe 和His[25]，以上氨基酸的含量显著增加。Cheison 等[22]认为含疏水性氨基酸残基的氨基酸的个数越多，多肽和生物体的脂质结合越强，则多肽的抗氧化活性越高。对多肽中的疏水性氨基酸（HAAs）进行统计发现，扫频超声显著增加了多肽中的疏水性氨基酸的含量，尤其是超声60 min 和90 min。从多肽的总氨基酸含量可以看出，扫频超声（尤其超声时间为30 min和60 min）增加了以多肽形式存在的氨基酸含量，即扫频超声增加了酶解产物中的多肽含量，降低了其中的自由氨基酸含量，该结果和β-LG 酶解产物的分子质量分布中的超声引起自由氨基酸（即＜200 u 的多肽）比例大幅度下降相互印证。

表2 不同超声时间对β-乳球蛋白酶解产物氨基酸组成的影响Table 2 Effect of different ultrasound pretreatment time on the composition of amino acids

2.7 超声时间对β-LG 的表面微观结构的影响

图5 为不同超声时间的超声处理对β-乳球蛋白表观形貌的影响。从图5 中可以看出在扫描电镜100 μm 的尺度下，β-LG 呈片状结构，10 min的超声处理后，大分子蛋白表面出现了明显的凸起，β-LG 出现了明显的裂痕和空洞，蛋白变得更加疏松。随着超声时间的延长，在超声处理时间为20～30 min 时，大面积片状的β-LG 消失，出现了大量的均匀小碎片。β-LG 小碎片的出现可能归结于超声引起的介质中气泡破裂时形成的局部热点，以及由微流和冲击波产生的剪切力[27]。当超声时间达到60～90 min 时，β-LG 碎片四周变得圆滑，碎片之间相互靠拢，连成一片，表明长时间的超声引起松散结构的β-LG 相互聚集，大分子蛋白间距离缩小，重新组装，形成了新的结构的聚集体。有研究发现超声能够使玉米蛋白[28]、乳蛋白[29]等蛋白结构变得疏松，并减少蛋白颗粒尺寸；也有研究发现超声能使牛血清白蛋白[30]、红豆蛋白[31]等蛋白形成聚集体。蛋白的种类、浓度对蛋白结构的变化均有很大影响，本研究表明超声工作参数对蛋白的结构具有显著影响，短时间的超声可以使蛋白结构松散，有利于蛋白的酶解，生物活性多肽的释放；然而，长时间超声处理则使蛋白颗粒变大，蛋白发生聚集，对蛋白酶解有阻碍作用。

图5 不同超声时间对β-乳球蛋白表观形貌的影响Fig.5 Effect of different ultrasound treatment time on the apparent morphology(scanning electron micrograph)of β-lactoglobulin

3 结论

不同时间的扫频式超声波预处理均能显著提高β-LG 酶解产物的抗氧化活性（P＜0.05），其中超声处理10～90 min 使得酶解产物的DPPH·清除率显著提高了7.97%～30.28%（P＜0.05）；Fe2+络合率增加了7.53%～15.76%（P＜0.05）。随着超声时间的延长，β-LG 酶解产物表面疏水性呈先增加后降低的趋势。扫频超声处理后β-LG 酶解产物表面疏水性增加了1.80%～9.55%。分子质量分布表明，扫频超声处理10～60 min 有利于分子质量在200～2 000 u 多肽的释放，从而提高了其酶解产物的抗氧化活性。扫频超声波更有利于β-LG 酶解液释放出更多的抗氧化肽。

β-LG 酶解产物的氨基酸分析研究表明，扫频超声波预处理后产物的疏水性氨基酸含量提高，这些都与酶解产物抗氧化活性的提高有关。利用扫描电镜，观察到扫频超声处理后β-LG 出现了明显的裂痕和空洞，蛋白变得更加疏松。长时间的超声引起了松散结构的β-LG 相互聚集，大分子蛋白间距离缩小，重新组装，形成了新的结构的聚集体。上述研究结果为蛋白质超声波加工技术的开发和设备的研制提供理论依据。