桑寄生提取物对人结肠癌HT-29细胞侵袭迁移的影响及作用机制

冯海洋 刘卓 付志璇

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来发病率居高不下，在全世界位居第三，我国发病率和死亡率也逐年升高[1-2]。对于结肠癌的治疗，目前采用以外科手术为主、化疗为辅的综合治疗方式，但是疗效并不理想，且药物毒副反应较大，肿瘤耐药明显，对患者的生存率提高不明显[3]。此外，临床上很大一部分患者在诊断结肠癌时已出现远处转移，失去了手术机会，治疗困难。可见，结肠癌的预后与是否发生转移密切相关[4]。因此，针对结肠癌侵袭转移的基础研究及药物研究，是当前结肠癌研究领域的热点。桑寄生富含茶酸、齐墩果酸、香树脂醇、黄酮类化合物、槲皮素和凝集素等有效成分，目前已被证实具有抗肿瘤、降血压、消炎镇痛及保护神经等作用[5]。为进一步探讨桑寄生的抗肿瘤作用机制，本研究就桑寄生提取物对人结肠癌HT-29细胞增殖及侵袭迁移的影响作一探讨，并阐释其可能的作用机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂 人结肠癌HT-29细胞（中国科学院上海生物细胞研究所）。桑寄饮片（安徽淮涛中药片科技有限公司）。DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；细胞计数试剂盒（CCK-8，日本同仁化学公司）；侵袭小室（Transwell）及基质胶Matrigel（美国BD公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒及SDS-PAGE胶试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；兔抗人基质金属蛋白酶 2（MMP-2）、MMP-9、血管内皮生长因子（VEGF）、鼠抗人AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K抗体（美国 Abcam公司）；GAPDH、HRP标记的羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗鼠IgG（杭州华安生物有限公司）；ECL发光检测试剂盒（美国赛默飞公司）。

1.2 桑寄生提取物制备 称取桑寄生饮片1 000g，蒸馏水冲洗2次，加入5 000g蒸馏水浸泡1h，文火煎煮30min；过滤，取滤液，残渣加入2 000g蒸馏水继续煎煮30min；再次提取滤液，合并两次滤液并旋转蒸发浓缩至100ml膏状提取物（相当于每ml含桑寄生药材10g），置于4℃冰箱冷藏备用。实验前取桑寄生提取物，用培养液倍比稀释制备相应实验浓度，0.22μm无菌滤器过滤后使用。

1.3 细胞培养 用DMEM培养基（内含10%胎牛血清、100g/L青霉素及100g/L链霉素）在37℃、5%CO2培养箱中培养人结肠癌HT-2细胞，待细胞生长至对数期进行传代及实验。

1.4 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。将对数生长期的HT-29细胞，用胰蛋白酶消化后制备单细胞悬液，以3 000个/孔接种于96孔培养板中，分为6组，每组设置3个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养过夜；吸取上清后，6 组分别在每孔加入 0、0.5、1、2、4、8g/ml浓度的桑寄生提取物100μl；分别于加药24、48、72h后，加入CCK-8试剂（10μl/孔），放入培养箱继续培养4h。利用分光光度计检测各孔在550nm的吸光度（OD值），细胞存活率（%）=OD 值加药组/OD 值空白对照组×100%，并计算细胞的半数抑制浓度（IC50）。

1.5 细胞侵袭能力检测 采用Transwell法。用无血清DMEM培养液按3∶1比例稀释基质胶，取30μl基质胶稀释液均匀包被Transwell小室，于4℃过夜、风干，置于24孔培养板备用；HT-29细胞经不同浓度桑寄生提取物（0、0.5、1、2g/ml）处理 24h 后，以 5×104个/200μl接种至Transwell上室，下室加入500μl含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养24h；棉签擦掉基质胶和上室底层细胞，4%多聚甲醛固定10min，磷酸缓冲盐溶液洗3次，0.1%结晶紫染液染色20min；取小室并在用清水洗净、晾干；在显微镜下拍照，随机选取5个视野计数细胞数，取平均值；计算桑寄生对HT-29细胞的侵袭抑制率，抑制率=（1-药物组细胞数/对照组细胞数）×100%。

1.6 细胞迁移能力检测 采用划痕实验。取对数生长期的HT-29细胞悬液，接种于6孔板内；将培养板置于培养箱内培养过夜；细胞长满后，用微量枪头划线；并设置0、0.5、1、2g/ml桑寄生提取物药物处理组，加药后继续培养；在0、24h时点取样，拍照。使用Image J软件，计算细胞迁移率。

1.7 相关蛋白表达检测 采用免疫印迹试验。HT-29细胞按照上述1.5药物分组处理48h；弃上清液，磷酸缓冲盐溶液润洗细胞3遍，加入RIPA裂解液，将细胞与细胞裂解液收集于1.5ml离心管中；12 000g离心10min，取上清液；按BCA蛋白定量试剂盒操作，检测各样品蛋白浓度，加入5×Loading制样，煮沸后每组取蛋白20μg上样 SDS-PAGE 胶，电泳（80V，60～90min），转膜（120V，2h）。取出膜，于5%脱脂牛奶中室温封闭2h；TBST清洗3次，加入一抗 4℃孵育过夜；TBST清洗3次，室温孵育二抗2h；TBST再次清洗，利用ECL显影并拍照。

1.8 统计学处理 采用GraphPad Prism 6.0统计软件。计量资料用表示，不同剂量组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；不同处理时间比较采用重复测量数据的方差分析，两两比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 桑寄生提取物对人结肠癌HT-29细胞增殖能力的影响 不同浓度（0、0.5、1、2、4、8g/ml）的桑寄生提取物处理细胞24、48、72h后，细胞存活率随着浓度的增加或时间的延长而降低，呈时间剂量依赖性（均P＜0.05），见图1。桑寄生提取物在24、48、72h对HT-29细胞的IC50依次为（6.1±0.2）、（3.5±0.3）、（2.2±0.2）g/ml。

2.2 桑寄生提取物对人结肠癌HT-29细胞侵袭能力的影响 HT-29细胞经1、2g/ml桑寄生提取物处理24h后，侵袭细胞数分别为（504±31）、（308±21）个，明显低于空白对照组的（644±52）个，差异有统计学意义（P＜0.05）；而0.5g/ml桑寄生提取物处理组侵袭细胞数为（588±81）个，与空白对照组比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见图2（插页）。

图1 不同浓度桑寄生提取物处理后HT-29细胞存活率

图2 不同浓度桑寄生提取物对HT-29细胞侵袭能力的影响（a：Transwell小室实验结果，×100；b：与空白对照组比较，*P＜0.05）

2.3 桑寄生提取物对人结肠癌HT-29细胞迁移能力的影响 经1、2g/ml桑寄生提取物处理24h后，HT-29细胞迁移率分别为（66.7±6.4）%、（26.7±3.1）%，较空白对照组（100.0±15.0）%明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；而0.5g/ml桑寄生提取物处理组细胞迁移率为（93.3±12.1）%，与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图 3（插页）。

图3 不同浓度桑寄生提取物对HT-29细胞迁移能力的影响（a：划痕修复实验结果，×4；b：与空白对照组比较，*P＜0.05）

2.4 桑寄生提取物对HT-29细胞侵袭迁移相关蛋白表达的影响 经0.5、1、2g/ml桑寄生提取物处理48h后，HT-29细胞侵袭迁移相关蛋白（MMP2、MMP9及VEGF）相对表达量明显低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 4。

2.5 桑寄生提取物对HT-29细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响 经0.5、1、2g/ml桑寄生提取物处理48h后，HT-29细胞PI3K、AKT蛋白相对表达量与空白对照组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；而p-AKT、p-PI3K蛋白相对表达量明显低于空白对照组（均 P＜0.05），见图 5。

图4 不同浓度桑寄生提取物对HT-29细胞内侵袭迁移相关蛋白表达的影响（a：电泳图；b：与空白对照组比较，*P＜0.05）

图5 不同浓度桑寄生提取物对HT-29细胞内PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响（a：电泳图；b：与空白对照组比较，*P＜0.05）

3 讨论

结肠癌患者预后及5年生存率，主要取决于癌细胞转移与否[6]。因此，针对抑制结肠癌转移的药物研究具有重要意义。目前，桑寄生在临床上已用于风湿痹痛、腰膝酸软、头晕目眩等疾病的治疗。随着对桑寄生有效成分的分析与研发，其在抗肿瘤方面的作用也被逐渐关注。如桑寄生总黄酮提取物能够有效抑制人白血病细胞株HL-6的增殖[7]；桑寄生凝集素能够有效抑制肝癌细胞株BEL-7402及胃癌细胞株MGC-823的增殖[8-9]。以上研究证明，桑寄生具有明确的抗肿瘤活性，但其作用机制并不清楚。为了进一步探讨桑寄生的抗肿瘤活性及其作一机制，本研究以人结肠癌细胞株HT-29为细胞模型，观察不同浓度桑寄生提取物对HT-29细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响，并分析可能的分子机制。结果显示桑寄生提取物能抑制人结肠癌HT-29细胞增殖、侵袭及迁移能力，同时下调细胞内侵袭迁移相关蛋白的表达，其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。

细胞侵袭与转移是一个复杂的过程，涉及多种信号通路及多种基因、细胞因子的调控[10-11]；因此，本研究从分子水平研究肿瘤细胞侵袭转移相关的机制。近年来研究证明，细胞外基质的降解是肿瘤侵袭转移的基础，MMPs作为细胞外基质蛋白酶的主要组成部分，对细胞基质的重塑和降解起着重要作用[12]。肿瘤细胞从原位脱落，分泌MMP，其中MMP-2及MMP-9降解细胞周围基质，是肿瘤细胞侵入血液及淋巴循环并向远处迁移、从而形成新转移灶的关键环节。研究表明，MMP-2、MMP-9与结肠癌的发生与转移密切相关[12-13]。在本研究中，空白对照组HT-29细胞内MMP-2、MMP-9蛋白呈高表达，而桑寄生提取物处理后的HT-29细胞内MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量明显降低，这说明桑寄生提取物能抑制人结肠癌HT-29细胞侵袭、转移能力，可能与抑制其MMP-2、MMP-9蛋白表达有关。VEGF是肿瘤血管生成的重要因子，与肿瘤转移密切相关；而VEGF途径抑制剂已成为肿瘤治疗的一种新治疗手段[14]。本研究结果发现，桑寄生提取物能降低HT-29细胞内VEGF表达量，从而抑制肿瘤细胞侵袭与转移。

PI3K/AKT信号通路是参与生命活动的关键信号通路，在肿瘤的发生、发展中起着重要作用[15]。研究表明，PI3K/AKT信号通路与结肠癌的发生、发展及化疗耐药等特性密切相关[16]。PI3K通过与其上游分子的作用引起PI3K结构变化，从而使AKT磷酸化而被激活，而活化的AKT通过调控其下游基因来参与肿瘤的增殖、侵袭等过程[15]。本研究结果显示，桑寄生提取物处理后的HT-29细胞内p-PI3K及p-AKT蛋白相对表达量明显降低，提示桑寄生提取物可能通过抑制PI3K/AKT信号通路，从而抑制人结肠癌细胞的侵袭与转移。

综上所述，桑寄生提取物能抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖、侵袭及迁移，其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。