产前发热对新生儿宫内细菌感染及脐血 miRNA-155、NF-κB信号通路指标的影响

张丽亚 陈黎丽 罗芳

宫内感染是指孕妇在围生期受病原体感染后致胎儿感染，是引起早产及一系列早产合并症的重要原因[1]。在新生儿感染中，越来越强调母体产前发热的影响；《新生儿败血症诊断及治疗专家共识（2019年版）》也强调了母体产前发热的地位[2]。miRNA-155诱导的核因子-κB（NF-κB）信号通路激活促使趋化因子和细胞因子过表达，在炎症发病机制中发挥着关键作用[3]。本研究就产前发热对新生儿宫内细菌感染的影响及及脐血miRNA-155、NF-κB信号通路指标的影响作一探讨，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018年1至12月在宁波市妇女儿童医院分娩的、产前体温＞37.5℃、无胎膜早破、经严格消毒后分娩的单胎孕妇及其新生儿200例为产前发热组，同期无产前发热但其余条件相同的100例单胎孕妇及其新生儿为健康对照组。产前发热组与健康对照组在年龄、孕次、产次、分娩孕周方面比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 1。排除标准：（1）最近 2 周使用过抗菌药物；（2）合并严重的心、肝、肾等脏器功能障碍性疾病；（3）合并糖尿病及妊娠高血压疾病。

1.2 方法

1.2.1 绒毛膜炎的诊断 在分娩时，距胎膜破口5cm出取大小约2cm×2cm的胎膜组织，常规甲醛固定石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察。组织学绒毛膜羊膜炎表现为绒毛膜及羊膜组织中有炎性细胞浸润。

1.2.2 新生儿宫内细菌感染的诊断 依据临床症状及血培养进行确定。判断标准：血培养阳性，临床表现为皮肤发灰、呼吸暂停、呼吸＞60次/min、呼吸功能不全、血压降低、嗜睡、心动过缓或过速、肌张力减低。

1.2.3 新生儿脐血炎症指标的检测 （1）样本采集：胎儿娩出后、断脐前采集脐血标本5ml，4℃、3 000r/min离心10min，收集血清，-80℃低温保存。（2）逆转录-聚合酶链反应检测脐血 miRNA-155、p65、p50、NF-κB 复合物抑制因子 α（IκBα）、IKB 激酶 β（IKKβ）、白细胞介素8（IL-8）的基因表达量：取200μl复溶的血清于离心管中，加入1ml Trizol试剂充分混匀裂解；分别用氯仿、异丙醇及DEPC水配制的70%乙醇处理；取DEPC-H2O溶解RNA，-80℃低温保存。使用紫外分光光度计、1%琼脂糖凝胶电泳分别测定RNA浓度和完整性。按照逆转录试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA并进行PCR扩增。miRNA-155（上游引物：GCCTTAATGCTAATCGTGATAG，下游引物：TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT），p65（上游引物：GCGAGAGGAGCACAGATACC，下游引物：CTGATAGCCTGCTCCAGGTC），p50（上游引物：CCTGGATGACTCTTGGGAAA，下游引物：TCAGCCAGCTGTTTCATGTC），IκBα（上游引物：GCAAAATCCTGACCTGGTGT，下游引物：GCTCGTCCTCTGTGAACTCC），IKKβ（上游引物：GCTGCAACTGATGCTGATGT，下游引物：TGTCACAGGGTAGGTGTGGA），IL-8（上游引物：CACCGGAAGGAACCATCTCA，下游引物：AAACTTCTCCACAACCCTCTGC），β-actin（上游引物：CGTGGACATCCGCAAAGAC，下游引物：CATCTGCTGGAAGGTGGACAG）。反应条件：94℃变性 2min；94℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 30s，40个循环。使用Smart View凝胶数字成像系统扫描分析扩增产物条带，分别测定各扩增带灰度值，以各目的基因扩增带灰度值比内参照β-actin扩增带灰度值作为基因相对表达量。（3）酶联免疫吸附测定检测脐血IL-8。超敏C反应蛋白（hs-CRP）水平，具体操作按试剂说明书进行。

表1 产前发热组与健康对照组产孕妇一般资料比较[例（%）]

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 产前发热组与健康对照组绒毛膜炎及新生儿宫内细菌感染发生率比较 产前发热组孕妇绒毛膜炎发生率为68.0%（136/200），明显高于健康对照组的15.0%（15/100），差异有统计学意义（P＜0.05）；新生儿宫内细菌感染发生率为50.0%（100/200），明显高于健康对照组的10.0%（10/100），差异亦有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 产前发热组与健康对照组新生儿脐血炎症指标比较 产前发热组 miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IL-8 基因表达量及IL-8。hs-CRP水平均明显高于健康对照组，IκBα基因表达量低于健康对照组，差异均有统计学意义（均 P＜0.05），见表 2。

2.3 产前发热程度与绒毛膜炎、新生儿宫内细菌感染发生率及新生儿脐血炎症指标的关系 以产前1周体温38.5℃为界，将产前发热的200例孕妇分为高热组92例、低热组108例。高热组孕妇绒毛膜炎、新生儿宫内细菌感染发生率，miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IL-8基因表达量及IL-8。hs-CRP水平均明显高于低热组，IκBα基因表达量低于低热组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 3。

2.4 产前发热时间与绒毛膜炎、新生儿宫内细菌感染发生率及新生儿脐血炎症指标的关系 以产前发热持续时间24h为界，将产前发热的200例孕妇分为长时间组80例、短时间组120例。长时间组孕妇绒毛膜炎、新生儿宫内细菌感染发生率，miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IL-8基因表达量及IL-8。hs-CRP水平均明显高于短时间组（均P＜0.05），IκBα基因表达量低于短时间组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

2.5 产前发热时间与发热程度的关系 产前发热长、短时间组孕妇发热程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表 5。

3 讨论

绒毛膜炎的最主要临床表现是母亲发热[4]，是新生儿败血症的危险因素之一。本研究结果显示产前发热孕妇绒毛膜炎发生率为68.0%，新生儿宫内细菌感染发生率为50.0%；进一步分析显示，发热程度越高，发热持续时间越长，新生儿宫内细菌感染发生率明显升高，分析原因可能是早产儿免疫系统发育不完善所致，随着母亲发热时间的延长，母婴感染的风险明显增高，临床医生应提高警惕。

研究表明，miRNA可调节TLR2/4-NF-κB信号通路[5-6]。miR-155是糖皮质激素发挥抑炎作用的新调控分子，糖皮质激素可通过抑制NF-κB下调miR-155表达，上调细胞因子信号转导抑制蛋白1表达，从而促进JAK激酶/信号转导和转录激活因子信号转导途径的激活，最终达到抗炎目的[7]。因此，深入研究NF-κB信号通路在产前发热造成宫内感染的激活情况、抑制细胞因子和趋化因子过表达引起的气道炎症，对于新生儿宫内感染的治疗具有重要作用。在静止细胞中，NF-κB与其抑制蛋白IκB结合，在细胞质中形成无活性的NF-κBIκB复合体。当细胞受到氧化。应激等因素的刺激后，IKKs活化，IκB在IKKs复合物的作用下发生磷酸化而降解，NF-κB与IκB解离并进入细胞核，进而调控细胞因子、趋化因子等基因的转录。本研究结果显示，产前发热孕妇分娩新生儿脐血 miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IL-8基因表达量及IL-8、hs-CRP水平均明显高于健康对照组，IκBα基因表达量明显低于健康对照组；产前发热孕妇绒毛膜炎及新生儿宫内细菌发生率明显高于健康对照组。这证实产前发热可导致miRNA-155-NF-κB信号通路的激活，同时绒毛膜炎与宫内细菌感染存在直接联系。进一步作亚组分析，结果显示产前发热程度及持续时间与新生儿宫内细菌感染的发生有关。但是本研究产前发热组孕妇绒毛膜炎及新生儿宫内细菌感染发生率高于其他文献报道[8-9]，可能与个体差异、入选偏倚因素等有关，故本研究结果仅作为该类疾病发病率的参考。

表2 产前发热组与健康对照组新生儿脐血炎症指标比较

表3 产前高、低热组孕妇绒毛膜炎、新生儿宫内细菌感染发生率及新生儿脐血炎症指标比较

表4 产前发热长、短时间组孕妇绒毛膜炎、新生儿宫内细菌感染发生率及新生儿脐血炎症指标比较

表5 产前发热长、短时间组孕妇发热程度比较[例（%）]

综上所述，产前发热孕妇绒毛膜炎及新生儿宫内细菌感染发生率较高，脐血miRNA-155基因表达上调，NF-κB信号通路激活；产前1周体温＞38.5℃或持续时间＞24h者表现更明显。对于产前发热孕妇，检测新生儿脐血 miRNA-155、p65、p50、IKKβ、IκBα、IL-8 基因表达及IL-8、hs-CRP水平等，有利于预测新生儿宫内细菌感染、尽早诊断与治疗。