钙蛋白酶-1在胶质瘤组织中的表达及其对U87细胞侵袭和迁移的影响

乔卿均 郭 晓 王淇民

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，虽然采用手术联合放、化疗可延长病人生存期，但胶质瘤病人中位生存期仍不足2 年[1，2]。研究表明，胶质瘤细胞向周围脑实质侵袭、迁移是导致其难以治愈的重要原因[3]。钙蛋白酶-1 是一种蛋白水解酶，与多种肿瘤细胞增殖、侵袭、转移能力有关，对肿瘤发生、发展具有重要作用[4]。本文探讨胶质瘤组织钙蛋白酶-1 表达变化及抑制钙蛋白酶-1 对U87 细胞侵袭和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集 2015 年 1 月至 2018 年 3 月手术切除的胶质瘤组织和瘤旁正常脑组织各57 例，WHO（2016版）分级Ⅱ级18例，Ⅲ级24例，Ⅳ级15例[5]；均为首发，且术前未进行放疗、化疗等辅助治疗。本研究获得本院伦理委员会批准。

1.2 U87细胞培养、转染及分组 将U87细胞（北京北纳创联生物技术研究院）置于含有10%胎牛血清的DMEM 中培养并传代。取对数生长期U87 细胞，接种于6孔板，参照LipofectamineTM2000（美国Invitrogen 公司）说明书，将阴性对照小干扰RNA（negative control-small interfering RNA，NC-siRNA）和钙蛋白酶-1 siRNA 分别转染至U87 细胞。将细胞分为3组：对照组（未转染细胞）、NC组（转染NC-siRNA）和钙蛋白酶-1组（转染钙蛋白酶-1 siRNA）。

1.3 RT-PCR检测钙蛋白酶-1 mRNA表达水平 使用Trizol 试剂（日本TaKaRa 公司）提取胶质瘤组织、瘤旁正常脑组织及U87细胞总RNA，反转录试剂盒（日本TaKaRa 公司）合成cDNA，使用SYBR Green RTPCR试剂盒（日本TaKaRa 公司）进行RT-PCR，以βactin为内参，2－ΔΔCt计算钙蛋白酶-1 mRNA相对表达量。RT-PCR 条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s；54 ℃退火60 s；72 ℃延伸 30 s；设置40 个循环；72 ℃延伸5 min。每个样本重复三次。

1.4 RT-PCR检测U87细胞转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-9 mRNA 表达水平 使用Trizol 试剂（日本TaKaRa 公司）提取U87 细胞总RNA，反转录合成 cDNA，RT-PCR 检测 TGF-β、MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平。

1.5 免疫印迹法检测胶质瘤组织、瘤旁正常脑组织和U87 细胞钙蛋白酶-1 蛋白表达水平 使用蛋白提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取胶质瘤组织、瘤旁正常脑组织及U87细胞总蛋白，定量后进行SDS-PAGE分离目的蛋白，转移至PVDF膜封闭2 h，加入钙蛋白酶-1 抗体一抗（1:200）4 ℃过夜，加入二抗（1:500）室温孵育1 h，显色后在GelDoc XR Biorad凝胶成像系统（美国Bio-rad公司）下扫描拍照，以βactin为内参，采用Image J软件分析每个样本蛋白条带灰度值与β-actin 条带灰度值之比，以其比值作为钙蛋白酶-1蛋白表达水平。

1.6 Transwell实验检测U87细胞侵袭能力 实验前将基质胶加入Transwell 小室中，37 ℃孵育30 min。将U87 细胞以每孔1×105个悬浮于无血清培养液中。取2 ml 悬浮细胞加入Transwell 小室的上室中，同时在下室中加入1 ml 含血清细胞培养液，培养24 h。用棉签擦掉膜顶部细胞，经4%聚甲醛固定20 min后，0.1%结晶紫染色，洗涤后，在200 倍显微镜下对随机5个视野区域进行细胞计数，重复3次。

1.7 划痕实验检测U87 细胞迁移能力 取培养24 h的U87细胞，用200 μl移液枪枪头在6孔板底部划出一条细痕，用PBS缓冲液将划下的细胞冲洗掉，继续培养 24 h，TS100 倒置相差显微镜（日本NIKON 公司）下放大100倍观察细胞迁移情况，并测量划痕宽度。细胞迁移率=（0 h 划痕宽度-48 h 划痕宽度）/0h划痕宽度×100%。重复3次。

1.8 统计学分析 应用SPSS 22.0软件分析，计量资料用表示，采用方差分析和t检验；以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质瘤组织钙蛋白酶-1 mRNA和蛋白表达水平变化 胶质瘤组织钙蛋白酶-1 mRNA 和蛋白表达水平均明显高于瘤旁正常脑组织（P＜0.05）。见图1。

2.2 U87 细胞钙蛋白酶-1 mRNA 和蛋白表达水平 钙蛋白酶-1 组U87 细胞钙蛋白酶-1 mRNA 和蛋白表达水平均明显低于对照组和NC组（P＜0.05），而对照组和NC组均无统计学差异（P＞0.05）。见图2。

2.3 细胞侵袭和迁移情况 钙蛋白酶-1 组U87 细胞侵袭数目明显低于对照组和NC组（P＜0.05），细胞迁移率明显低于对照组和NC 组（P＜0.05）；对照组和NC 组U87 细胞侵袭数目和细胞迁移率均无统计学差异（P＞0.05）。见图3。

2.4 U87 细胞 TGF-β、MMP-2 和MMP-9 mRNA 表达水平 钙蛋白酶-1 组 TGF-β、MMP-2 和 MMP-9 mRNA 表达水平均明显低于对照组和NC 组（P＜0.05），而对照组和NC 组均无统计学差异（P＞0.05）。见图4。

3 讨论

图1 胶质瘤组织和瘤旁正常脑组织中钙蛋白酶-1 mRNA和蛋白表达水平

图2 各组U87细胞钙蛋白酶-1 mRNA和蛋白表达水平

图3 各组U87细胞侵袭和迁移情况

图4 各组U87细胞TGF-β、MMP-2和MMP-9水平比较

钙蛋白酶-1是重要的胞质蛋白水解酶，与乳腺癌、卵巢癌、胃癌等转移和侵袭行为有关[6]。本文结果显示，胶质瘤组织钙蛋白酶-1 mRNA 和蛋白表达水平均显著高于瘤旁正常脑组织，说明钙蛋白酶-1在胶质瘤中呈高表达。研究报道，钙蛋白酶-1在口腔鳞状细胞癌中高表达，与癌细胞侵袭和迁移有关，其作用是扰乱细胞周期、抑制MMP和上皮间质转化实现的[7]。肿瘤转移是癌症难治及死亡原因之一，而癌细胞侵袭和迁移是肿瘤转移的重要标志[8]。本文结果表明，沉默人胶质瘤U87 细胞钙蛋白酶-1 表达后，细胞侵袭和迁移能力明显下降，说明沉默钙蛋白酶-1 表达可有效抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移。癌细胞上皮间质转化过程是肿瘤恶化表现之一，不仅与肿瘤转移有关，与肿瘤治疗抵抗和复发也密切相关[9]。上皮间质转化过程导致的一系列生理病理改变过程主要依赖于MMP 等降解细胞外基质的蛋白酶[10]。TGF-β是MMP和下游Smad信号的调节因子，可增强MMP诱导的退行性变化，是诱导上皮间质转化的重要因子[11]。谭维军等[12]研究表明，TGF-β诱导肺疾病肺泡上皮间质转化通过上调钙蛋白酶实现，而钙蛋白酶抑制剂可抑制上皮间质转化发生。本文结果发现，沉默U87 细胞钙蛋白酶-1 表达，细胞MMP-2、MMP-9、TGF-β表达水平显著降低，说明沉默钙蛋白酶-1 表达，可能通过抑制上皮间质转化，抑制癌细胞侵袭和迁移。

总之，人脑胶质瘤钙蛋白酶-1 呈高表达，与肿瘤细胞侵袭和迁移有关，抑制钙蛋白酶-1 表达，可能通过抑制TGF-β、MMP-2、MMP-9表达，影响上皮间质转化而抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移。这提示钙蛋白酶-1可能是胶质瘤发生、发展中重要的生物标志物，对胶质瘤临床治疗及预后评估具有指导意义。