不同发酵时间对酵母发酵的影响

吴雪君，刘黔霞*，张 红，杨晓健，刘美霞，王凤霞*

（1.瓮福（集团） 有限责任公司，贵州 贵阳 550000；2.中低品位磷矿及伴生资源高效利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550016）

酵母是一种单细胞真菌，属于兼性厌氧型微生物。在有氧的条件下，能够进行有氧呼吸，将糖类物质分解成二氧化碳和水；在无氧的条件下，能够进行无氧呼吸（酒精发酵），将糖类物质分解成二氧化碳和酒精。酵母是一种天然发酵剂，在食品领域中的应用历史悠久，以酿酒和面制品发酵为人们所熟悉，其应用已扩大到药品、食品添加剂、保健食品、调味品、饲料、培养基成分等方面。国内外酵母开发的方向主要有三个方面：一是对传统酵母进一步研发，提高生产技术，降低生产成本和提高原料的利用率；二是通过酵母基因表达外源蛋白，发展生物制药；三是开发富集功能因子的功能性酵母，将营养酵母和功能性酵母深加工后制成营养保健食品。本文为验证发酵时间对酵母菌发酵的影响特设计相关试验。

1 实验部分

1.1 原料及试剂

试验菌种：酵母菌（贵州大学生命科学学院菌种保存室提供）。

试剂：磷酸二氢钾、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、硫酸铵、氯化钠、氢氧化钠、氢氧化钾等，以上试剂均为分析纯。

培养基及试剂配制：培养基参照《微生物学实验教程（第四版）》[4]进行配制。

YPD液体培养基：酵母粉7.5g、蛋白胨20g、硫酸铵5g、葡萄糖20g，加水1000mL，121℃，高压灭菌30min。

1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取0.1g的无水葡萄糖，待完全溶解后定容至100mL。

DNS显色液：分别取6.3g DNS和262 mL 2mol/LNaOH溶液，加至500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加入5g结晶酚5g亚硫酸钠，搅拌溶解冷却后加水定容至1000mL。贮存于棕色瓶中备用。

1.2 主要仪器和设备

精密天平、立式压力蒸汽灭菌锅（BXM-30R）、恒温振荡培养箱 (DHP-9052B)、超净工作台（带紫外灯）、偏光显微镜、石墨加热板（DB-XAB）、紫外可见分光光度计（PE Lambda）等。

1.3 实验方法

1.3.1 酵母发酵

1）取活化好的菌落斜面一支，以1mL0.9%生理盐水冲洗菌苔，待完全冲洗干净后，吸取1mL接种到250mLYPD液体培养基中，置于30℃、120r/min的恒温培养振荡器，培养24h即得酵母种子液。

2）各试验组的YPD液体培养基配制好后按照试验要求分装于500mL三角锥瓶中，每瓶250g，灭菌备用，共计24瓶。保留6瓶培养基不接种菌种，做为空白对照。放入4℃冰箱待测。

3）接种种子液。将剩余的培养基按接种量为4%接种，置于30℃、120r/min的恒温培养振荡器培养，待发酵36h、72h、108h后取出，一次取出6瓶放入4℃冰箱待测。

4）待108h发酵结束后将各组的发酵液倒入离心瓶于5000r/min离心10min待测。

1.3.2 检测方法

1）发酵液残糖量测定[6]：根据甘蔗总糖含量测定方法进行发酵液中残糖量测定。取4mLDNS溶液于50mL容量瓶中，加入2mL已于5000r/min离心10min的发酵液样品，补加纯水至15mL，摇匀溶液，置于沸腾的水浴锅中加热5 min取出，迅速用自来水冷却至室温；用纯水定容至50mL。以DNS试剂调零，按照吸收光谱的测定结果，选取最佳波长进行检测。

2）酒精量测定[7]：参照国家标准黄酒中酒精含量测定方法进行发酵液中酒精量的测定。取已离心的发酵液，过0.22μm无菌水系滤膜。过滤完的液体即为待测样品，进行气相色谱上机检测。

3）总酸、氨基酸态氮测定：参照国家标准黄酒中总酸、氨基酸态氮含量测定方法进行测定，产生的总酸量是以发酵36、72、108h后发酵液中总酸量减掉空白对照组中原有总酸量、氨基酸态氮量所得；产生的氨基酸态氮量是以发酵36、72、108h后发酵液中氨基酸态氮量减掉空白对照组中原有氨基酸态氮量所得。

1.3.3 数据处理方法

采用SPSS17.0软件中对实验数据进行分析，多重比较（LSD）确定组间差异，结果以“均值±标准误”表示，标注相同字母（P＞0.05） 表示无差异，标注不同字母（P<0.05） 表示存在差异，EXCEL软件作表。

2 结果与分析

2.1 发酵液残糖量测定

2.1.1 吸收光谱的测定

检测葡萄糖的入射光的波长应根据吸收光谱，选择具有最大吸收时的波长为宜，选择波长190nm到750nm进行扫描。由图1可知，在500nm处具有最大吸收峰，因此葡萄糖含量检测选择max=500nm较为合适。

图1 葡萄糖吸收光谱

2.1.2 葡萄糖标准曲线测定

在500nm波长处，以浓度为0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10 mg/mL的葡萄糖标准溶液，对吸光度绘制工作曲线。线性方程为：y=7.5828x-0.038，R2=0.9963.

2.2 酒精测定

发酵36、72、108h后发酵液中酒精度分别为2.07%、4.62%、7.93%（体积分数）。酒精度作为酿酒酵母发酵能力最重要的指标，与酵母糖转化利用率相对应，糖转化利用率高则相应酒精度高，反之糖转化利用率低则相应酒精度低。见图2、图 3。

2.3 总酸、氨基酸态氮测定

总酸含量用来判定酵母产酸能力，酸类物质虽不是酒类的香气成分，但其是主要的呈味物质。但酸含量需适中，否则将影响酒类的色、香、味。酒含有多种氨基酸，其中有些还是人体必需氨基酸。氨基酸大多自身具有甜、苦、涩、鲜等味感，还能被酵母进一步代谢生成重要风味物质高级醇，因此也作为酵母发酵能力的一项重要指标。

图2 酒精标准曲线

图3 不同发酵时间产酒精图谱

2.4 发酵液指标分析结果

酵母发酵后的变化情况见表1所示。

表1 酵母发酵不同时间后指标变化结果

由表1可知，酵母发酵36、72、108h后，发酵液中残糖量分别为：18.75、10.37、5.42g/L。发酵液中残糖量可以反应酵母对糖的转化利用能力，试验初始培养基中含糖量相同，发酵结束后残糖量低，说明酵母对糖的转化利用率高，发酵能力强。由此说明发酵108h酵母对糖的转化利用率比发酵36h和72h的高；酒精含量分别为2.07、4.62、7.93%vol，说明随着发酵时间的延长，发酵液中产生的酒精越多。产总酸量分别为：3.17、5.14、5.11g/L；产氨基酸态氮量分别为0.46、0.87、0.85g/L，说明在发酵培养72h后，酵母产生的总酸量和氨基酸态氮量最高。

3 结语

由试验结果可知，酵母菌发酵液中残糖量随着发酵时间延长逐渐减少；产生的酒精量随着发酵时间的增加而增加；产生的总酸量和氨基酸态氮含量则是在发酵72h以后趋于稳定。由此可知酵母菌在不同发酵时间产生的代谢产物量不同，应根据具体需求进行发酵时间的调整。