用复合修饰电极示差脉冲伏安法快速测定叶酸含量

王苏霞，马永钧

（甘肃省生物电化学与环境分析重点实验室，化学化工学院，西北师范大学，甘肃 兰州 730070）

叶酸（Folic Acid，FA） 又称为碟酰谷氨酸，是一种B族水溶性维生素，在一些新鲜水果、蔬菜、肉类食品中含量丰富。但是，游离叶酸的性质极不稳定，在光照或加热的条件下容易发生分解。人体叶酸摄入不足时会导致一系列疾病，例如巨细胞性贫血、白细胞减少、精神障碍等，亦会增加心脏病发作和中风的可能性。孕妇缺乏叶酸还有可能导致胎儿发育迟缓、神经管缺陷，心血管疾病等胎儿畸形问题[1-2]。因此，建立快速、准确地测定叶酸的分析方法为保障人体健康具有重要的意义[3-4]。

目前，叶酸检测的方法主要有分光光度法[5]、液相色谱法[6-7]、毛细管电泳法[8]和荧光法[9]和电化学方法[10-11]。然而，除电化学方法外，大多数测定叶酸的方法在实际应用时仪器成本相对较高、分析过程也较为复杂。例如，虽然液相色谱法具有高灵敏度、高选择性的优点，但在操作过程中，不可避免地要使用大量有机溶剂，且对测试样需要做一些复杂的预处理。叶酸在电极上既可电氧化又可电还原，Gurira等[12]人讨论了叶酸的电化学还原机理及电解质pH值对其伏安性质的影响。Kretzschmar等[13]人采用极谱法，研究了叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸的电还原机理。近年来，由于采用化学修饰电极测定叶酸的过程相对简单，且方法稳定较好，已被用于食品、药剂中叶酸含量的测定[14-15]，但测定叶酸的化学修饰工作电极易毒化失活的问题尚未根本解决。

氨基酸中含有的羧基和氨基官能团具有独特的鳌合和吸附作用，因此应用电化学聚合方法可以将氨基酸聚合到不同电极表面上，制备可用于检测目标化合物的电化学传感器[16-17]。近年来，含稀土元素杂金属氰桥配位聚合物的化学修饰材料被广泛的用于电化学传感器，这种聚合物膜修饰电极具有高选择性、高灵敏度和优异的电催化活性与抗电极毒化失活的能力，对一些生物小分子具有高效的电催化氧化作用[18-19]。因此，本文将聚谷氨酰胺修饰层与CyHMCP材料进行复合修饰，成功制备出一种新型的复合修饰玻碳电极(Poly(L-glutamine)/Ho(III)-Fe(III)-WO42-CyHMCP/GCE)，利用该电极对叶酸的电催化氧化活性，建立了一种直接、快速测定实际试样中叶酸含量的新方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

电化学工作站（CHI 760B，上海辰华仪器公司）；酸度计（PB-10，德国赛多利斯仪器有限公司）；磁力搅拌器（85-2，中国国华仪器公司）。电化学实验均采用三电极测试体系，以直径为3 mm的修饰或者未修饰的玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl（0.1 mol·L-1KCl）为参比电极。

谷氨酰胺（含量≥99%，阿拉丁试剂）；氧化钬（含量≥99.99%，阿拉丁试剂）；铁氰化钾（A.R，经重结晶纯化）；三聚氰胺（含量≥99.5%，阿拉丁试剂）；叶酸（FA，含量≥97%,阿拉丁试剂）。其余试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水，所有测试均在室温条件下进行。标准储备溶液置于4℃的冰箱冷藏室中保存。

10mmol/L叶酸标准溶液的配置：称量0.1138g叶酸固体，溶于Na2CO3（C=0.10mol/L）中。1mmol/L和0.1 mmol/L的叶酸标准溶液均由10 mmol/L叶酸溶液用Na2CO3（C=0.05mol/L） 稀释所得。

1.2 Poly(L-glutamine)/Ho(III)-Fe(III)-WO42-CyHMCP/GCE的制备过程

裸玻碳电极 （GCE） 依次用 0.3μm及 0.05 μm的Al2O3悬浊液抛光至镜面，用麂皮擦拭电极表面残留Al2O3，再将此电极依次用无水乙醇、去离子水中分别超声清洗2min，最后用蒸馏水冲洗干净，备用。

参考文献方法[20]，先将电极进行预处理。把 GCE放入 10mL磷酸盐缓冲溶液 （PBS，0.10mol/L，pH=7.0） 中，在1.7V的电位下阳极氧化处理400 s，接着在0～1V范围内循环扫描20圈后取下电极，将电极表面氧化产生的过量黑色物质用滤纸轻轻擦去，用水冲洗。再参照文献方法[19,21]，将活化后的GCE置于含2.50μmol/L谷氨酰胺，0.10mol/L PBS缓冲溶液 (pH=9.3)，0.10mol/L Na2SO4的电解质溶液中，在-0.9～2.23V电位区间内循环扫描5圈后取出，用蒸馏水冲洗电极表面。再修饰含钬杂金属氰桥配位聚合物膜(Ho(III)-Fe(III)-WO42-CyHMCP)，置于电沉积CyHMCP电镀液中，用循环伏安模式，在电位区间0.6～-0.32 V，扫速17mV·s-1的条件下，循环扫描4圈。此电镀液组成为Ho3+(10.0mmol/L，2.25 mL)，三聚氰胺 (10.0mmol/L，1.50mL)，一氯乙酸-氢氧化钠缓冲溶液 (0.20mol/L，5.0mL，pH1.63)，KNO3(0.5mol/L，0.86mL)，Fe(CN)63+(10.0mmol/L， 0.45mL) ， Fe3+(10.0mmol/L，23.3μL)， WO42-(10.0mmol/L， 0.28 mL)， 曲 通（1.0%，1.4 mL），电镀完成后将修饰好的电极用二次蒸馏水冲洗干净、备用。

1.3 实际样品处理

所需样品均购买于当地超市。菠菜、芹菜、苹果等样品按以下程序进行预处理：将样品切碎，各称取25.00g，放入研钵中研磨处理后，置于 50mL水溶液 （组成：50mmol/L NaOH，50mmol/L Na2SO4，2.5mmol/L硼砂溶液） 中超声提取 30min，再进行离心分离 (12000r/min，10min)；不同品牌的叶酸片样品准确称量后放入研钵中研碎，转移至50mL比色管中，在加入50mmol/L NaOH，50mmol/L Na2SO4，2.5mmol/L 硼砂溶液，定容至刻度，超声提取30min，再离心分离 (12000r/min，10min)，取一定量的上清液进行电化学测定。

1.4 实验步骤

在10mL比色管中，准确加入0.10mol·L-1PBS 缓冲溶液 (pH=8.0)，0.3mol·L-1的 Na2SO4溶液及一定量的叶酸标准溶液或样品溶液，用超纯水定容，充分摇匀后转移至石英电解池中，采用三电极体系，用示差脉冲伏安法（DPV），在磁力搅拌的条件下富集50s，停止搅拌后静止5s，进行电化学实验。仪器参数设置为：脉冲宽度（60ms），脉冲高度（100mV），脉冲间隔时间（200ms），在0.20～0.90V电位区间记录示差脉冲伏安图并读取叶酸的氧化峰电流值。采用标准加入法进行实际样品中叶酸含量的定量，以外推负截距值计算待测液中叶酸的含量。

2 结果与讨论

2.1 复合修饰电极的稳定性及对叶酸的电催化性能

根据文献可知，叶酸在裸玻碳电极上几乎观察明显的氧化峰[22-23]，而采用本实验修饰的新型电极后，用含40.0μmol·L-1叶酸标准样品溶液连续扫描10次的示差脉冲伏安曲线时，观察到叶酸具有明显的伏安响应峰（如图1所示）。此外，在多次连续扫描过程中所得到叶酸的氧化峰峰形，峰电流值、峰电位值重现性均很好，这说明此复合修饰电极对叶酸的电催化活性及稳定性良好。

图1 叶酸在修饰电极上连续扫描的示差脉冲伏安图。

2.2 支持电解质的影响

在测定叶酸时，本文比较了磷酸盐缓冲溶液(PBS)、稀硫酸溶液、Tris-HCl缓冲溶液等作为支持电解质时叶酸的伏安行为。实验发现若其他条件相同时，在稀硫酸电解质溶液中，叶酸会同时出现两个氧化峰，不便于定量分析。而在Tris-HCl缓冲液电解质中，叶酸的检测灵敏度、电流响应能力较低。再参照文献[23]，也观察到叶酸在碱性条件下化学稳定性优于酸性条件。因此，以含25.0μmol·L-1叶酸标准样品为测试液，用DPV法考察了PBS缓冲液的浓度和pH值对叶酸电化学响应的影响。由图2可知，当浓度为0.10mol·L-1，pH=8.0时，叶酸的响应电流值达到最大。所以本方法以PBS为测定叶酸的最佳支持电解质。

图2 支持电解质浓度 (A)和pH值 (B)对叶酸峰电流的影响。

2.3 叶酸的氧化峰电流与扫速的关系

用线性扫描伏安法 (LSV)研究了叶酸的峰电流与扫描速度 (Ip～v)的关系，如图3所示，实验发现当扫描速率在0.05～0.60V/s范围变化时，随着扫速的增加，叶酸的氧化峰电位正移，响应电流逐渐增加，符合不可逆电化学氧化反应的特征。叶酸的氧化峰电流与扫速呈良好的正比线性关系 (图3插图)，拟合方程为：Ip(μA)=5.074+16.42 v(V/s)，R2=0.9981，这说明在此修饰电极上，叶酸的电催化氧化反应属于典型的吸附控制过程。

图3 修饰电极上叶酸标准溶液在不同扫速下的线性扫描伏安曲线（插图为叶酸氧化峰电流与扫描速率的关系）。

2.4 定量分析叶酸的工作曲线

在最佳实验条件下，以复合修饰电极工作电极，所记录叶酸的伏安响应曲线如图4所示。随着待测样品中叶酸浓度的增加，其氧化峰电流也相应增大。实验数据显示，在5.00～600μmol·L-1的浓度范围内，叶酸的氧化峰电流与其浓度呈现良好的线性关系 (见图4内插图)，线性回归方程为 Ip(μA)=-0.04017+0.01159CFA(μmol·L-1)，R2=0.9994；检出限 (S/N=3) 为 2.0μmol·L-1。此外，在实验过程中还观察到叶酸在此复合修饰电极上亦可进行电催化还原，这种现象与聚次甲基蓝修饰玻碳电极上叶酸的电还原性质相似[24]。但文献中采用循环伏安法的阴极峰电流为定量参数，其定量分析叶酸的线性响应范围只有0.1×10-3～2.9×10-3mol/L狭窄的一个数量级左右。这主要是伴随电还原过程，叶酸在工作电极上会产生强的不可逆吸附，甚至电极上还有可能发生局部的电聚合作用导致了工作电极被污染、毒化失活，使定量分析工作难以为继。而本实验采用叶酸的电氧化峰电流为分析参数就可以避免电极污染问题，使本分析方法应用于实样测定的准确度得到极大的提高。

图4 不同浓度叶酸的示差脉冲伏安图（插图为叶酸的氧化峰电流和浓度间的标准曲线）

2.5 共存干扰物的影响

以质量浓度为18.0 mg·L-1的叶酸标准样品为检测样，我们考察了加入一些干扰物为测定基底物质对叶酸峰电流的影响。结果证明：若以峰电流值变化幅度小于±5%内为界限，添加80倍的KNO3、NaNO3、NaCl，40 倍的葡萄糖，30 倍的蔗糖，60倍的果糖，20倍的草酸钠，5倍的L-抗坏血酸，40倍的尿素、淀粉、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，5倍的赖氨酸对叶酸的测定均无明显影响。这说明限量存在的这些基底干扰物质对检测叶酸的影响均不大，也证明此复合修饰电极具有良好的选择性和抗干扰性能。

2.6 实际样品分析

准确移取一定体积的2.3中所得的待测液，按2.4的步骤，用标准加入法进行叶酸含量的测定。不同样品中叶酸含量的测定结果如表1所示，其回收率在95.9%～109%。从表1中数据可以得出，三种不同品牌的叶酸片，经过预处理，测得叶酸的含量为其理论值的96.7%～108%，这说明用本方法对叶酸片中叶酸的定量准确、可靠，结果令人满意。在几种蔬菜及水果中并未检测到叶酸，但在进行加标测定实验中，计算得到实样的加标回收率能达到95.9%～99.4%，表明此复合修饰电极上的适用性良好，叶酸的检测也并未受实际样品中已有复杂基底成分的干扰，本方法的选择性良好。

表1 药片和食品中叶酸含量的测定结果及回收率 (n=3)。Table 1 Determination results of folic acid content in the real samples (n=3).

3 结语

本实验在Poly(L-glutamine)/Ho(III)-Fe(III)-WO42-CyHMCP/GCE复合修饰玻碳电极上研究了叶酸的电催化氧化行为，初步解决了用化学修饰工作电极测定叶酸时易毒化失活的问题，据此建立了一种快速、直接测定叶酸片中叶酸含量的新方法，本方法的样品前处理简单、电极稳定性好、抗毒化性能强、线性范围宽，对几种实际样品中叶酸含量进行了测定，回收率达到95.9%～109%，测定结果令人满意。