二乙基二硫代氨基甲酸钠比色法在茶叶铜含量检测中的优化

李 茜，樊竹青，黄竹珺，李媛媛，胡俊超，李学玲*

（1.普洱学院生物与化学学院，云南 普洱 665000；2.云南省高校亚热带药用食用生物资源开发与利用重点实验室，云南 普洱 665000）

作为世界茶源，中国是世界茶叶种植生产和出口的主要国家。但近30年来，部分进口国以保障食品安全为由，对我国实施不合理的绿色贸易壁垒，成为我国茶叶对外贸易的重要阻碍[1-2]。为打破绿色壁垒，保障茶叶出口贸易，我国积极应对，出台茶叶的绿色食品标准，规定了铜的限量标准为w（Cu） ≤30mg/kg[3-4]。

目前茶叶中铜含量的测定多采用原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体发射光谱法、紫外分光光度法 (二乙基二硫代氨基甲酸钠比色法)等方法。原子吸收光谱法，电感耦合等离子体质谱发和电感耦合等离子体发射光谱法等在科研院所、高校和检测机构中使用较普遍，但因仪器设备昂贵，大多茶叶生产厂家采用二乙基二硫代氨基甲酸钠比色法来完成铜含量检测也能满足要求。其检测原理为二乙基二硫代氨基甲酸钠 (DDTC)与铜在碱性溶液中反应，可生成棕黄色络合物，用四氯化碳萃取实现分光光度检测。但DDTC与铜所生成的棕黄色Cu(Ⅱ)-DDTC络合物在水相中易见光分解，且存在有机相萃取不完全的情况，降低了检测的重复性和精确度[5-6]。同时本方法使用的四氯化碳是公认的肝脏毒物，可通过呼吸道、消化道、皮肤吸入中毒，中毒大多表现为麻痹中枢神经、损害肝肾、麻醉作用[7]，对操作人员身体健康具有潜在危害。解决上述问题的关键为增强棕黄色Cu(Ⅱ)-DDTC络合物在水相中的稳定性，简化有机相萃取步骤。非化工级聚乙烯醇 (PVA)是一种无毒害、无副作用、安全的高分子类非离子表面活性剂。本研究旨在以聚乙烯醇 (PVA)醇羟基为亲水基团，聚乙烯链为亲油基团，形成胶束，保护棕黄色Cu(Ⅱ)-DDTC络合物在水相体系中稳定存在来优化二乙基二硫代氨基甲酸钠比色法。

1 材料和仪器

1.1 原料

普洱熟茶、普洱生茶、碧螺春、古树茶、银芽五种茶叶，购于普洱市茶叶贸易市场。

1.2 试剂

四氯化碳、柠檬酸铵、硫酸、氨水、柠檬酸铵、二乙基二硫代甲酸钠 (DDTC)、酚红指示剂、五水合硫酸铜、镁粉、硝酸镁、盐酸、聚乙烯醇(PVA)为分析纯。

1.3 仪器

紫外可见光分光光度计 (岛津公司，UV-2550)；马弗炉 (上海市崇明实验仪器厂，SX2-4-10)；电子天平 (上海精科天美天平仪器厂，FA3204B)；鼓风干燥箱 (上海慧泰仪器制造有限公司，DHG-9245A)

2 实验方法

2.1 样品前处理

准确称取10g茶样于坩埚内，加入1g镁粉，再加入10%硝酸镁10mL，小火加热，炭化至无烟，在马弗炉中以550℃灰化5h至无炭粒。加适量12mol/L HCl溶解并用水定容至100mL，摇匀。

2.2 优化法标准曲线制作

分别取 0.00mL、0.25mL、0.50mL、0.75mL、1.00mL、1.25mL铜标准使用液 (10mg/mL)于25mL比色管中，加20%柠檬酸铵1.0mL，滴入2滴酚红指示剂，摇匀，用氨水 (1+1)调紫粉色至透明无色，加0.1%DDTC溶液1.0 mL和2%PVA 2.0mL，振摇1min后，静置3min，以空白液调零，在紫外分光光度计440nm处测样品吸光值。

2.3 优化法样品测定

取1.0mL样品消化液于25mL比色管中，以下同2.2标准曲线操作，以标准曲线计算消化液和空白液铜质量。

计算公式如下：

式中：ρ为试样中铜的质量浓度 (mg/L)；A1—测定用试样消化液中铜的质量 (μg)；A2为试剂空白液中铜的质量 (μg)；V1为试样消化液的总体积(mL)。

3 结果与分析

3.1 线性关系及灵敏度对比

据对比优化法和原法工作曲线（如图1所示）可见，两种方法均呈现良好的线性关系，优化法的R2为0.9998，原法的R2为0.9994，若以吸光度A=0.01为可重现值时，则原法检出限为0.0202μg/25 mL，优化法检出限为 0.0042μg/25 mL，优化法的灵敏度较原法提高了近5倍。

图1 优化法和原法标准曲线

3.2 回收率实验对比

取5份茶样分别加入其铜含量的80%、100%、120%的标准品，用优化法和原法进行加样回收实验。优化法的回收范围在98.6%～106.7%之间，平均回收率为102.3%，原法的回收范围在92.4%～101.4%之间，平均回收率为96.2%。由此可见优化法回收率高于原法。

3.3 精确度对比

对5种不同的茶样分别用优化法和原法平行测定6次，结果见表1。根据对比标准偏差和RSD可知，优化法的精密度明显高于原法。

3.4 铜含量检测结果对比

表1 优化法和原法精确度对比

利用优化法和原法分别测定市场取样的普洱熟茶、普洱春茶、碧螺春、古树茶、银芽五个茶样的铜含量，结果如表2所示。对比两种方法检测茶叶中铜含量可见检测数值相近，但优化法灵敏度高于原法。我国绿色茶叶标准NY 288-2018规定，绿色茶叶中铜含量的限值是w（Cu） ≤30mg/kg，根据结果可知，检测的5个茶样均符合绿色茶叶标准。

表2 优化法与原法中铜含量的对比

4 结论与讨论

传统二乙基二硫代氨基甲酸钠比色法因仪器简便易得，是食品中铜离子检测常使用的方式，但是却存在操作复杂，利用四氯化碳等有毒试剂，污染环境，对人体有毒害性，实验中指示剂显色不稳定，萃取不完全等缺点。本研究通过优化法和原法的标准曲线拟合度、回收率实验的检出限和灵敏度以及相对标准偏差比较可以证明溶液萃取比色法的优化法对茶样中铜含量的检测更为精确。同时利用优化法和原法分别测定了市场随机采样中的五种茶叶，检测结果均低于我国绿色茶叶标准NY 288-2018限量。

优化法的溶液萃取比色法是可行的，所以在实验中优化法的聚乙烯醇 (PVA)可以取代原法的四氯化碳作为Cu(Ⅱ)-DDTC络合物在水相中的稳定剂，提高了实验人员的操作安全，符合现代检测环保理念。同时优化法改进了原法溶液萃取比色法中存在的显色络合物不稳定，铜离子萃取不完全的问题，简化了四氯化碳萃取步骤，提高了实验的准确率，为茶叶中铜含量的检测提供了新方法。