分离自1例COPD患者的Aspergillus lentulus菌株对蜡螟幼虫生存率、体表黑色素化及活动度的影响

姬名硕，王晓东，美日哈巴·阿西木，张丽娟，夏日克亚·玉素甫江，帕丽达·阿布利孜

新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐 830054

近年来，侵袭性真菌感染(IFI)患者逐年增多，目前已成为许多疾病致病和致死的重要病因[1]。尽管IFI的诊断技术和治疗手段取得了一定的进展，但侵袭性曲霉菌病患者经治疗后病死率仍>50%[2,3]。近年来，IFI的真菌谱也在发生变化，以往常见的白色念珠菌感染呈下降趋势[4]，而以往不常见的曲霉菌感染比例上升[5]。新的曲霉菌株也不断出现，比如曲霉属的新种A.lentulus、A.udagawae、A.viridinutans、A.thermomutatus。在这些新曲霉菌中，文献报道最多的就是烟曲霉菌的姊妹菌A.lentulus，然而目前对该菌的毒力、流行率和发病机制尚不清楚[6]。为探究A.lentulus的毒力，我们把1例慢性阻塞性肺疾病(COPD)老年男性患者痰标本中分离出的A.lentulus为观察对象，并以A.lentulus标准菌株、烟曲霉菌、白色念珠菌作对照，将各菌株分别感染蜡螟幼虫，并比较蜡螟幼虫的生存率、黑色素化、活动度，旨在评价A.lentulus的毒力强弱，为探索更有效的IFI治疗方法提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源、培养、分离及菌悬液配置A.lentulus患者菌株(菌号：XYZ 10188，由2011年新疆医科大学第一附属医院收治的1例患有5年COPD的老年男性患者痰标本中分离)、A.lentulus标准菌株(菌号：XYZ 10192)、烟曲霉菌(菌号：XYZ10110)、白色念珠菌(菌号：XYZ9013)均来自新疆医科大学第一附属医院皮肤科实验室。上述各菌分别接种在MEA 9 cm培养皿中，37 ℃培养生长。A.lentulus培养9 d(本研究预实验显示A.lentulus9 d后毒力较强)，烟曲霉菌、白色念珠菌培养4 d，之后开始配制菌悬液。每株菌用灭菌的10 μL的PBS液进行3次的菌苔洗脱。用干净棉棒轻轻擦拭菌落表面，尽可能多的将菌落中孢子洗脱至PBS中，用移液器将菌液转入带有玻璃棉的注射器过滤到收集管中。用白细胞计数板(25×16型计数板)在显微镜下计数孢子数量，并计算菌液浓度，孢子数/mL=80个小格的孢子总数/80×400×10 000×稀释倍数，得到浓度除以所需要的浓度即为稀释倍数，稀释后的菌液即为所得浓度。

1.2 蜡螟幼虫分组、菌株注射方法及蜡螟幼虫生存、体表黑色素化、活动度观察 选取体表颜色发白的蜡螟幼虫70只，并分为7组，均给予400 μL相应菌株或PBS，A组每只蜡螟幼虫右侧尾足处注射1×104CFU的A.lentulus患者菌株，B组每只注射1×105CFU的A.lentulus患者菌株，C组每只注射1×106CFU的A.lentulus患者菌株，D组每只注射1×106CFU的A.lentulus标准菌株，E组每只注射1×106CFU的烟曲霉菌，F组每只注射1×106CFU的白色念珠菌，G组每只注射PBS。每组中的每个菌测试10只蜡螟幼虫，每5只蜡螟幼虫分别分装在2个铺有滤纸的9 cm的干净培养皿中备用。将各组蜡螟幼虫放入37 ℃培养箱中培养72 h，记录感染0、2、18、24、48、72 h蜡螟幼虫的生存率，参照文献[7,8]的体表黑色素化及活动度评分标准评价上述各时点蜡螟幼虫的体表黑色素化情况及活动度。

2 结果

2.1 各组不同时点蜡螟幼虫生存率 不同时点蜡螟幼虫生存率见表1。由表1可知，A组在观察时间段内，0 h生存率最高，在24 h开始发生死亡，生存率降至96.67%，48、72 h生存率未发生明显变化与24 h时相同，生存率最低(P均>0.05)。B组结果与A组相同。C组在观察时间段内，0 h生存率最高，在18 h开始发生死亡，生存率降至约66.67%，随着时间的推移生存率逐渐降低，在72 h生存率最低约为20.00%(P均<0.05)。D组0 h生存率最高，在18 h开始发生死亡，生存率降至96.67%，随着时间的推移生存率逐渐降低，在72 h生存率最低约为36.67%(P均<0.05)。E组在0 h生存率最高，在18 h开始发生死亡，生存率降至20.00%，在24 h内全部死亡(P均<0.05)。F组在0 h生存率最高，在18 h开始发生死亡，生存率降至60.00%，在24 h内全部死亡(P均<0.05)。G组在观察时间段内，在0 h生存率最高，在24 h开始发生死亡，生存率降至96.67%、随着时间的推移生存率逐渐降低，在72 h生存率最低约为93.33%(P均>0.05)。在18、24、48、72 h，7组整体比较都具有统计学差异(P均<0.05)。不同浓度A.lentulus比较，在18、24、48、72 h，A、B组比较，P均>0.05，A、C组比较，B、C组比较，P均<0.05。不同菌株间比较，在18 h时，C、D组比较，P均>0.05；24、48、72 h时，C、D组比较，P均<0.05。18、24、48、72 h，C组分别与E、F组比较，P均<0.05。在18 h时，E组与F组比较，P>0.05。18、24 h时，C、E、F组与G组比较，P均<0.05。在48、72 h，C、D、E、F组与G组比较，P均<0.05。

表1 各组不同时点蜡螟幼虫生存率

2.2 各组不同时点蜡螟幼虫体表黑色素化评分 不同时点蜡螟幼虫体表黑色素化评分见表2。由表2可知，A组在观察时间段内，0 h体表黑色素化评分最高，在2 h开始下降，48 h降至最低(P均>0.05)。B组在观察时间段内，0 h体表黑色素化评分最高，在2 h开始下降，72 h降至最低(P均>0.05)。C组在观察时间段内，0 h体表黑色素化评分最高，在2 h开始下降，72 h将至最低(P均<0.05)。D组在观察时间段内，0 h体表黑色素化评分最高，在2 h开始下降，72 h降至最低(P均<0.05)。E组在观察时间段内，0 h体表黑色素化评分最高，在2 h开始下降，24 h内蜡螟全部死亡，评分降至最低(P均<0.05)。F组在观察时间段内，0 h体表黑色素化评分最高，在2 h开始下降，24 h内蜡螟全部死亡，评分降至最低(P均<0.05)。G组在观察时间段内，0 h体表黑色素化评分最高，在18 h开始下降至最低评分后，随着观察时间增加未发生变化(P均>0.05)。在0 h时，7组整体间比较未见统计学差异(P均>0.05)。在2、18 h、24、48、72 h，7组整体比较都具有统计学差异(P均<0.05)。不同浓度A.lentulus比较，在2、18、24、48、72 h，A、B组比较，P均>0.05;A、C组比较，B、C组比较，P均<0.05。不同菌株间比较，在2、18、24、48、72 h，C、D组比较，E、F组比较，P均>0.05；C组分别与E、F组比较，P均<0.05。2、18、24、48、72 h时，A、B组与G组比较，P均>0.05。在2、18 h，C、D组与G组比较，P均>0.05；在24、48、72 h，C、D组与G组比较，P均<0.05。在2、18、24、48、72 h，E、F组与G组比较，P均<0.05。

表2 各组不同时点蜡螟幼虫体表黑色素化评分(分，

2.3 各组不同时点蜡螟幼虫活动度评分 不同时点蜡螟幼虫活动度评分见表3。由表3可知，A组在观察时间段内，活动度评分未发生明显变化，在0 h活动度评分最高，在48 h开始下降至最低评分，72 h未发生变化(P均>0.05)。B组变化结果和A组类似。C组在观察时间段内，0 h活动度评分最高，在2 h开始下降，72 h将至最低(P均<0.05)。D组在观察时间段内，0 h活动度评分最高，在18 h开始下降，72 h降至最低(P均<0.05)。E组在观察时间段内，0 h活动度评分最高，在2 h开始下降，24 h蜡螟全部死亡，评分降至最低(P均<0.05)。F组在观察时间段内，0 h活动度评分最高，在2 h开始下降，18 h蜡螟全部死亡，降至最低(P均<0.05)。G组在观察时间段内，0 h评分最高，在18 h开始下降至最低评分后，随着观察时间增加未发生变化(P均>0.05)。在2、18、24、48、72 h，7组整体比较都具有统计学差异(P均<0.05)。不同浓度A.lentulus比较，在2、18、24、48、72 h，A、B组比较，P>0.05，A、C组比较，B、C组比较，P均<0.05。不同菌株间比较，在2、18、24、48、72 h，C、D组比较，E、F比较，P均>0.05；C组分别与E、F组比较，P均<0.05。2、18、24、48、72 h时，A、B组与G组比较，P均>0.05。在2、18 h，C、D组与G组比较，P均>0.05。在24、48、72 h，C、D组与G组比较，P均<0.05。在2、18、24、48、72 h，E、F组与G组比较，P均<0.05。

表3 各组不同时点蜡螟幼虫活动度评分比较(分，

3 讨论

蜡螟幼虫模型最初应用于细菌病原体中[9,10]，近年已扩展到真菌，病毒等病原体中并取得了一定进展[11]。蜡螟幼虫作为小型哺乳动物(如小鼠和大鼠)的替代宿主模型该模型，已运用于宿主与病原体的相互作用的研究，不仅限于研究真菌感染的发病机理和抗真菌药物的作用机理，也可用于宿主防御真菌病原体的研究[12～15]，病原体对药物的敏感度、药物毒力研究[16～18]。昆虫免疫反应在结构和功能上与哺乳动物先天免疫反应具有相似性，尤其是蜡螟幼虫血细胞和哺乳动物中性粒细胞都具有吞噬并杀死病原体的作用[19]，并且在免疫应答过程中可发生体表黑色素化更加有利于实验观察。基于以上蜡螟动物感染模型的特点，本实验采用蜡螟作为A.lentulus毒力的初步研究有一定的基础支持及研究价值。

A.lentulus是Balajee等于2005年在4例造血干细胞移植患者分泌物中分离鉴定并作为烟曲霉菌的姊妹菌而成为新纪录菌[1]。此后由于人们对A.lentulus认识的不断提高，日本[20]、巴西[21]、瑞士[22]、西班牙[23]、阿根廷[24]、土耳其[25]等一些国家医学家已经在接受心、肝、肾器官移植患者、慢性阻塞性肺气肿患者、囊性纤维化等患者的支气管肺泡灌洗液，痰液标本中分离到A.lentulus，尽管A.lentulus是烟曲霉菌的姊妹菌，但是与烟曲霉菌相比具有独特之处，如培养菌落呈现白色棉絮状，产孢少，有小分生孢子头，温度超过48 ℃不能生长，KOH直接镜检可见粗大有分隔分叉的透明菌丝。A.lentulus用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)分离培养基在37 ℃下培养2周，可见灰白色绒毛状菌落，背面呈现灰白色或灰白色，镜下可见分生孢子头。烟曲霉菌及白色念珠菌作为临床真菌学中最常见、研究最深入的真菌，而A.lentulus是烟曲霉菌的姊妹菌，以烟曲霉菌作为对照更能突出A.lentulus在烟曲霉菌菌属中毒力的强弱。本研究显示，蜡螟幼虫生存指标呈浓度依赖性，A组各项生存指标较B、C组下降明显。各组菌株感染的蜡虫生存指标随着观察时间的延长而呈下降趋势。同一时段不同菌株间生存指标比较，A、B、C组生存率下降较D组慢，体表黑色素化及活动度评分两者比较无统计学差异；A、B、C组各生存指标较E、F组下降慢。

总之，A.lentulus患者菌株对蜡螟生存率、体表黑色素化、活动度的影响均较白色念珠菌和烟曲霉菌弱，对蜡螟生存率的影响较A.lentulus标准菌株弱，对黑化作用及活动度的影响与A.lentulus标准菌株相当。