不同贮存时间对酸橙枳实药材的质量影响Δ

徐俊达，张 涵，石敬依，蔡文君，罗 容#（.首都医科大学中医药学院，北京 00069； .天津中医药大学研究生院，天津 3067）

枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensisOsbeck 的干燥幼果［1］，是传统的“六陈”中药之一。 所谓“陈药”是指这些药物陈久放置后入药，药效更佳或毒性更低。 南北朝梁代《本草经集注》中记载6 味中药需陈用，“凡狼毒、枳实、橘皮、半夏、麻黄、吴茱萸，皆欲得陈久者良，其余须精新也”，说明上述6 味药通过陈化后更能满足临床用药需要［2-3］。 此后，《新修本草》、李东垣《珍珠囊指掌补遗药性赋》及张从正《儒门事亲》等文献中记载的陈药均有枳实。

如何界定中药陈化时限一直是陈药研究中的一个难点。历代本草或方书众说不一，有1 年、2 年、3 年甚至数十年者，也有“陈年”“多年”“年久”和“陈久”等不能明确具体时间的说法；即使同一种药物，陈化时间亦有不同［2］。 此外，枳实的陈久存放是否会对其已明确的除挥发油外的其他药效组分产生实质影响还未见报道。

枳实药材主要含有挥发油类、黄酮类、生物碱类和香豆素类等成分［4-6］。 辛弗林是《中华人民共和国药典》（2015 年版）中枳实的定量质控成分，通常被认为是枳实的特征成分。 黄酮类化合物是枳实的主要有效成分［6-7］。 本研究结合本草论述和现代药效物质基础的研究结果，以酸橙枳实为研究对象，以辛弗林、新橙皮苷、柚皮苷、野漆树苷、川陈皮素、橙皮苷和芸香柚皮苷含量为质量评价指标，建立同时测定新橙皮苷、柚皮苷、野漆树苷、川陈皮素、橙皮苷和芸香柚皮苷的超高效液相 色 谱 法（ ultra-high performance liquid chromatography，UPLC），初步比较不同贮存时间对枳实药效组分的影响，以期为枳实陈用提供科学依据，为枳实陈化时限提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent-1100 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；WATERS ACQUITY UPC2 型超高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；WG-43 型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；YP601N 型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；DFT-150 型手提式高速中药粉碎机（上海左乐仪器有限公司）；KQ5200DV 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市英峪仪器厂）。

1.2 药品与试剂

对照品：辛弗林，批号110727-0036；新橙皮苷，批号111857-201102；柚皮苷标准物质，批号110722-201312；野漆树苷，批号111919-201102；橙皮苷，批号：110721-201014；酸橙枳实对照药材，批号1120936-201005；以上对照品及对照药材均购于中国食品药品检定研究院。 川陈皮素，批号MUST-13041206，北京恒元启天化工技术研究院和北京世纪奥科生物技术有限公司联合研制；芸香柚皮苷标准物质，批号14259-46-2，北京北纳创联生物技术研究院生产。 色谱级乙腈（批号181005，Fisher Chemical 公司）；色谱级甲醇（批号181102，Fisher Chemical 公司）；乙酸（批号20150807，天津市福晨化学试剂厂）；实验用水为屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。

1.3 枳实样品

枳实药材除7 号样品外，均购于中药材市场。 所有样品均为新货，见表1。 枳实药材每年5—6 月产新，新货进入市场一般为当年6 月以后。 中药材市场收集的样品中，收集日期为上半年的均为前一年所产，收集日期为下半年的均为当年所产。 7 号样品为研究者于2016 年上半年收集于樟树某实验林场，为2016 年当年所产。 所有样品规格均为半球形，直径为1～2 cm。 贮存条件为常温（10 ～30 ℃），避光，密闭。 样品由首都医科大学中医药学院罗容博士鉴定及与酸橙枳实对照药材进行薄层鉴别，所有样品为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果。 样品保存于首都医科大学中药资源与鉴定实验室。

表1 酸橙枳实药材信息表Tab 1 Information of immature fruit of citrus aurantium

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液：分别精密称取芸香柚皮苷、柚皮苷、野漆树苷、新橙皮苷和川陈皮素对照品适量，置于5 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成各对照品储备溶液，质量浓度分别为1.132、2.536、1.064、3.162 及1.066 g／L。 精密称取橙皮苷对照品适量，置于25 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为0.350 4 g／L 的对照品储备溶液。 精密称取辛弗林标准品适量，用水定容至5 ml，摇匀，制成质量浓度为0.246 mg／ml 的对照品储备溶液。

2.1.2 供试品溶液：取枳实药材粉末0.5 g（过65 目筛），精密称定，置圆底烧瓶中，加水10 ml，100 ℃水浴提取1 h，过滤，将2 次滤液合并至蒸发皿中，浓缩至约10 ml，转移至25 ml 容量瓶中，水定容至25 ml，作为供试品溶液。

2.2 色谱条件

（1）黄酮类化合物检测色谱条件在参考文献［8］的基础上改进如下。 WATERS ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；VanGuard 预柱；流动相为水（A，含0.2%冰醋酸）-乙腈（B），梯度洗脱（洗脱条件为0～15 min，95%～80%A；15～25 min，80%～75%A；25～28 min，75%～60%A；28～35 min，60%～0%A）；检测波长330 nm；柱温30 ℃；流速0.3 ml／min；进样量1 μl，自动进样。 （2）辛弗林检测色谱条件如下。Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相为甲醇-水（V∶V＝1 ∶1），水相中含磷酸二氢钾0.06%、十二烷基磺酸钠0.1%和冰醋酸0.1%；检测波长275 nm；柱温30 ℃；流速1.0 ml／min；进样量10 μl，自动进样。 酸橙枳实对照品及样品的色谱图见图1。

2.3 线性关系及检测限

将“2.1.1”项制得的样品，分别稀释至如下质量浓度，依次自动进样。 柚皮苷对照品储备液稀释配制成质量浓度分别为0.507、1.014、1.521、2.028 及2.536 g／L。 新橙皮苷对照品储备液稀释配制成质量浓度分别为1.054、1.581、2.108、2.635 及3.162 g／L。 橙皮苷对照品储备液稀释配制成质量浓度分别为0.116 8、0.175 2、0.233 6、0.292 0 及0.350 4 g／L。 芸香柚皮苷对照品储备液稀释配制成质量浓度分别为0.056 6、0.113 2、0.169 8、0.226 4 及0.283 0 g／L。 川陈皮素对照品储备液稀释配制成质量浓度分别为0.010 66、0.021 32、0.031 98、0.042 64 及0.053 30 g／L。 野漆树苷对照品储备液稀释配制成质量浓度分别为0.010 64、0.021 28、0.031 92、0.042 56 及0.053 20 g／L。 辛弗林对照品储备液稀释配制成质量浓度分别为0.017 35、0.034 71、0.052 06、0.069 41、0.086 77及0.104 10 g／L。 按“2.2”项下色谱条件，以进样质量浓度X（μg／ml）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并计算检测限（S／N≥3）及定量限（S／N≥10），结果见表2。

表2 标准曲线及定量限和检测限结果Tab 2 Standard curve and quantitation and detection limit results

2.4 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，重复进样6 次，测定峰面积以此计算RSD。 芸香柚皮苷、柚皮苷、野漆树苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素和辛弗林的RSD分别为0.71%、0.76%、1.11%、0.77%、0.91%、0.89%和0.46%，表明精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12 和24 h 进样，以芸香柚皮苷、柚皮苷、野漆树苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素和辛弗林的色谱峰峰面积计算RSD，分别为1.44%、0.76%、4.37%、1.93%、0.72%、0.60%和2.38%，表明该供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6 重复性试验

称取同一批枳实干燥粉末6 份，按“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液，再按“2.2”项下色谱条件测定枳实中芸香柚皮苷、柚皮苷、野漆树苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素和辛弗林含量的RSD分别为1.59%、1.77%、2.34%、2.73%、1.76%、2.27%和1.38%，表明该方法的重复性良好。

2.7 加样回收试验

分别称取枳实干燥粉末5 份，每份约0.25 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液。 吸取已知含量（含生药10 mg／ml）的5 份枳实水提供试液1 ml，分别精密加入等同于药材样品含量的7 种对照品，用甲醇定容至10 ml，混匀，再按“2.2”项下色谱条件进行测定，进样量为10 μl。 测定各成分的含量，计算芸香柚皮苷、柚皮苷、野漆树苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素和辛弗林的平均加样回收率及RSD，结果见表3。

表3 加样回收率测定结果（n＝5）Tab 3 Recovery rates of spiked samples （n＝5）

2.8 样品含量测定

取10 个不同批次的枳实药材粉末（过65 目筛）约0.5 g，精密称定，按“2.1.2”项操作方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行分析，计算芸香柚皮苷、柚皮苷、野漆树苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素和辛弗林的含量，结果见表4。

表4 不同贮存时间酸橙枳实药材7 个成分的含量测定结果（±s，%，n＝3）Tab 4 Contents of seven ingredients in immature fruit of citrus aurantium samples with different storage time （±s，%， n＝3）

表4 不同贮存时间酸橙枳实药材7 个成分的含量测定结果（±s，%，n＝3）Tab 4 Contents of seven ingredients in immature fruit of citrus aurantium samples with different storage time （±s，%， n＝3）

编号 芸香柚皮苷 柚皮苷 野漆树苷 橙皮苷 新橙皮苷 川陈皮素 辛弗林1 1.241 9±0.009 3 9.176 0±0.003 5 0.074 9±0.000 2 0.758 0±0.001 8 6.800 0±0.001 4 0.119 7±0.000 4 0.340 8±0.000 3 1.084 4±0.014 8 9.615 8±0.006 9 0.099 7±0.000 4 0.780 5±0.001 8 9.213 2±0.005 5 0.119 7±0.000 1 0.339 7±0.000 3 3 0.796 6±0.003 8 6.795 5±0.010 4 0.075 9±0.000 3 0.703 8±0.002 2 5.921 8±0.004 3 0.119 6±0.000 2 0.355 3±0.000 9 4 0.656 0±0.001 1 6.649 9±0.001 9 0.072 0±0.000 4 0.870 1±0.003 2 9.033 9±0.002 9 0.042 4±0.000 1 0.151 1±0.000 7 5 1.005 8±0.007 7 7.632 6±0.018 6 0.097 4±0.000 4 0.713 5±0.002 5 7.182 3±0.002 0 0.130 6±0.000 3 0.291 1±0.000 6 6 0.716 7±0.006 9 8.013 6±0.014 5 0.074 3±0.000 2 0.673 0±0.001 6 9.013 5±0.002 3 0.067 6±0.000 1 0.315 7±0.000 6 7 0.426 5±0.000 7 6.889 4±0.004 6 0.064 9±0.000 3 0.859 6±0.002 8 13.878 7±0.008 0 0.058 7±0.000 1 0.246 0±0.000 7 8 1.152 5±0.011 0 5.970 2±0.015 7 0.093 7±0.000 5 0.920 6±0.001 8 9.089 6±0.004 1 0.097 3±0.000 3 0.337 7±0.000 6 9 0.633 8±0.000 4 0.173 4±0.000 4 0.019 7±0.000 3 0.557 0±0.000 9 0.150 8±0.000 4 0.080 1±0.000 1 0.344 6±0.000 5 10 1.070 1±0.007 7 4.293 4±0.005 9 0.057 7±0.000 2 1.150 2±0.004 8 11.336 0±0.006 4 0.095 0±0.000 4 0.468 4±0.000 2 2

2.9 不同贮藏时间和药效组分含量之间的关系

以贮藏时间为横坐标，药效组分含量为纵坐标做曲线图，见图2。 其中，贮存时间为6 年、4 年以及3 年对应的纵坐标为2 号和3 号、5 号和6 号、7 号和8 号样品中各成分含量的平均值。 比较不同贮藏时间的酸橙枳实中药效组分芸香柚皮苷、柚皮苷、野漆树苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素和辛弗林的含量随贮存时间的变化趋势。 枳实中辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、野漆树苷及川陈皮素含量与贮存时间未呈现出递减或递增规律。 相同贮存时间的样品中药效组分的含量差异大于不同贮存时间的样品，样品的其他信息对于所测药效组分的影响可能大于贮藏时间。 芸香柚皮苷与橙皮苷含量波动与贮存时间关系不大。 野漆树苷与川陈皮素在枳实中含量较低，随时间变化其含量变化幅度较小。 除了贮存时间为2 年的9 号样品，其他样品随贮存时间延长柚皮苷含量有升高趋势，新橙皮苷含量有降低趋势。 辛弗林含量与贮存时间之间无明显规律性。

图2 酸橙枳实不同贮藏时间与其内部各成分含量变化曲线图Fig 2 Variation curve of different storage time and the contents of immature fruit of citrus aurantium

3 讨论

3.1 关于研究样品

样品均为来源于酸橙的药材枳实，规格均选择了半球形，直径为1～2 cm，排除了品种和规格的干扰，但未能完全排除产地、采收时间等其他因素的影响。 研究不同贮存时间对枳实质量的影响，理想的样品是同一批样品在不同贮存年限时分别进行药效组分的含量测定，并对数据进行比对分析。 本研究是选择不同贮存时间的不同样品进行研究。 不同贮存时间的样品为市场随机抽取的样品，但样本量有限，未能做到同一贮存时间的多样本重复研究。 针对研究中涉及的10 份样品，在贮存7 年以内的时限中，其辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、野漆树苷及川陈皮素含量与贮存时间未呈现出递减或递增规律。

贮存时间为2 年的9 号样品中，柚皮苷、新橙皮苷含量与贮存时间相邻的1 年和3 年样品相比分别相差近20 ～30 倍、60～70 倍。 推测与该样品其他信息有关，与贮存时间无关。 故在做柚皮苷、新橙皮苷与贮藏时间相关趋势分析时，剔除了该样品。 但进一步的药效组分含量与贮藏时间的相关性分析还需更多的样品研究支撑。

3.2 陈药用药及陈化时限的科学依据

陈药的使用是中医用药的特色之一。 但对于陈药用药的科学依据，除陈皮外，其他陈药陈用机制相关研究较为薄弱。 直接针对枳实陈用机制的研究报道不多。 根据目前对枳实化学成分的研究成果，结合陈皮陈用的机制研究结果［9-15］，推断枳实陈用的机制可能是随着贮存时间的延长其挥发油的含量降低，从而使其对胃肠道刺激的副作用降低。 在样本量有限的前提下，本研究的数据依然提示，不同贮存时间的枳实样品，其辛弗林和黄酮类药效组分含量有所不同，有的波动范围较大。 其中，柚皮苷和新橙皮苷含量与贮存时间有一定关联趋势可循。 从前期众多文献报道中［16-20］可知，本研究中所用样品测量出的药效组分含量波动并不大于文献报道中产地、采收时间及品种等因素造成的含量波动。 7 年内不同贮存时间，酸橙枳实药材质量未见明显差异，可作为枳实“陈久者良”的科学依据之一。 随着枳实贮存时间的继续延长，是否会对枳实的辛弗林和黄酮类药效组分产生影响，还需要进一步追踪，枳实的陈化时限还未能确定。 挥发油也是枳实的有效成分，并且挥发油含量与贮存时间的相关性较强。 枳实挥发油的含量与贮存时间的变化规律还需进一步研究，同时辅以药效组分与功效的量效关系研究，有望为枳实陈用及陈化时限提供更多的科学支撑。

3.3 辛弗林含量

影响枳实药材生物碱含量的因素主要有品种、产地、规格、采收时间和贮存时间等［16-20］。 4 号、5 号和7 号样品中辛弗林的含量未达到《中华人民共和国药典》（2015 年版）要求的最低限度0.30%。 5 号和6 号样品贮存时间均为7 年，产地均为江西，6号样品辛弗林含量符合标准；7 号和8 号样品贮存时间均为3年，8 号样品辛弗林含量符合标准。 推测辛弗林含量未合格与其贮存时间、品种和规格关系不大，可能与样品其他因素有关。

3.4 含量测定方法

本研究同时建立了UPLC 法测定枳实中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、野漆树苷及川陈皮素6 种黄酮类成分的含量测定方法。 《中华人民共和国药典》（2015 年版）枳实辛弗林含量测定方法中，对枳实样品的处理步骤较复杂，本研究中简化了样品处理方法。 通过方法学考查，所建立的方法可行，可为定量评价枳实质量提供参考。