蒙古族奶嚼口与下层凝乳中乳酸菌的筛选和比较研究

徐伟良，李春冬，多拉娜，雅 梅，2，郭 梁，2*

（1.锡林郭勒职业学院生物工程研究院，内蒙古锡林浩特 026000；2.锡林郭勒职业学院食品检验检测和风险评估中心，内蒙古锡林浩特 026000）

嚼口又名嚼克，蒙语称“桌禾”，是蒙古族特色发酵奶油类食品中的一种。奶嚼口的传统制作工艺是以牛奶自然发酵后漂浮在上层的乳白色脂肪为原料，经沥乳清、搅打、低温水洗、灌装等工艺制成[1]。但由于其工序繁杂、耗时较多，随着人民生活节奏的加快，传统制作工艺接近失传。现市场上所售卖的奶嚼口多为生产加工奶豆腐时的一种附属产品。即在制作生产奶豆腐时，将新鲜牛奶不经过杀菌处理，直接过滤除杂后放入干净容器中，静置在蒙古包或室内的阴凉处自然发酵，发酵温度在20 ℃左右，发酵时间夏季1～2 d，冬季3～4 d[2-4]。在发酵结束后，表层会出现一层成分多为乳脂的白色稠状物质，即为奶嚼口，而下层即为用作奶豆腐制作前体的下层凝乳。

蒙古族传统奶嚼口芳香浓郁，营养丰富是一种高油脂类乳制品。其口感略酸，食用时经常加一些白糖或拌炒米食用，是蒙古人招待宾客的上等食物。根据刘文丽等[5-6]对蒙古族传统奶嚼口的理化和营养成分研究报道可知，其固形物平均含量为91.25%，还有多种人体必需的氨基酸、有机酸等风味物质和营养成分。但对传统发酵奶嚼口发酵时，下层凝乳和奶嚼口之间营养成分和微生物组成的关系却未见报道。目前，奶嚼口的生产仍处于传统的手工作坊阶段，自然发酵的开放状态和制作工艺的操作对其安全性和品质有着非常不利的影响。另外，手工作坊式的生产技术使嚼口的制作难以标准化，这也是制约其产业化发展的技术瓶颈。

蒙古族发酵奶嚼口和下层凝乳利用自身环境中的微生物进行低温自然发酵，不仅保留了乳品的天然品质特色，而且其中蕴藏着丰富的乳酸菌资源。但若想使乳酸菌在人体中发挥益生作用，必须经过消化道中低酸环境及高胆盐环境的筛选，并能成功定植在肠道中才能发挥其功能。奶嚼口是鲜奶发酵后析出的一种高油脂类乳制品，而下层凝乳多为水分、蛋白质等组分，由于两者间营养成分的不同，故推测两者中乳酸菌的种类和数量也应存在着差异。本实验通过对蒙古族发酵奶嚼口和下层凝乳中菌株进行分离、筛选、鉴定以及利用耐酸耐胆盐实验进行发酵性能比较研究，以期从中发掘优良发酵特性的乳酸菌资源，为蒙古族传统奶嚼口和奶豆腐发酵菌剂的开发和进一步产业化生产应用提供有益借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品及原料来源

自然发酵奶嚼口和下层凝乳样品均采自内蒙古锡林郭勒盟地区的牧民家中。纯牛奶（蛋白质5%，脂肪6%，碳水化合物2%）：市售。

1.1.2 试剂及引物

两性霉素B（2.5 mg/L）：美国Sigma公司；Code No.9164 Takara快速提取试剂盒：大连宝生物工程公司；EasyTaq聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）Super Mix：北京全式金生物技术有限公司；细菌通用引物27F和1495R：由北京睿博生物科技有限公司合成。

1.1.3 培养基

MRS液体培养基、MRS固体培养基：北京路桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

HWS-250BX恒温恒湿培养箱：天津泰斯特仪器有限公司；SW-J-2FD净化工作台：苏州博莱尔净化设备有限公司；Nanodrop 2000c核酸蛋白测定仪：美国Thermo Fisher公司；2720 Thermal Cycler PCR扩增仪：美国BIO-RAD公司；UV9100A紫外分光光度计：北京莱伯泰科仪器股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品采集

新鲜牛奶经锡林郭勒地区牧民家中低温自然发酵3 d后，取上层奶嚼口及下层凝乳分别装入无菌采样袋中，并编号为XS-Z和XS-E，4 ℃条件下保存，尽快送回实验室进行菌种分离。

1.3.2 样品中乳酸菌的计数、分离和纯化

样品中乳酸菌计数参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》[7]。采取平板涂布法进行菌种分离。取1 mL新鲜采集的奶嚼口（编号XS-Z）和下层凝乳（编号XS-E）样品加入9 mL含0.85%生理盐水的试管内，进行连续梯度稀释，选取3个适宜的梯度，于MRS平板培养基上进行涂布，将MRS平板倒置于37 ℃恒温培养箱中，厌氧培养2～3 d。待观察有菌落生长后，分别挑取100株单菌落于5 mL MRS液体培养基中进行连续纯化培养2代。将菌落进行革兰氏染色、镜检。将经过检验的革兰氏阳性菌用30%甘油进行冻存，保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.3.3 菌株产酸凝乳能力筛选

将菌株取出复苏后，用MRS液体培养基连续活化3代，按2%（V/V）接种量接种至纯牛乳中，于37 ℃条件下培养，并以最终发酵8 h时的酸度（吉尔涅尔度，°T）、pH及凝乳状态（是否凝乳、凝块的颜色、风味，是否均匀、润滑，有无龟裂及乳清分离等现象）作为筛选标准，进行产酸凝乳菌株的筛选。用pH酸度计直接测定发酵上清液pH，参照国标GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》中的方法测定滴定酸度[8]。

1.3.4 菌株耐酸、耐胆盐能力筛选

（1）耐酸性试验

用1 mol/L的HCl溶液调节MRS液体培养基的pH值至2.0、3.0、4.0、5.0，以初始MRS液体培养基（pH 6.5）为对照，将产酸凝乳筛选出的菌株按2%（V/V）接种量接种于不同pH值梯度的培养基中，并以不接菌种的MRS培养基为空白对照，于37 ℃厌氧培养16 h，测各组菌液的OD600nm值，其生长率计算公式如下[9]：

式中：c为生长率，%；An为培养基pH为2.0、3.0、4.0、5.0时的OD600nm值；A1为pH初始培养基的OD600nm值；A0为空白对照培养基的OD600nm值。

（2）胆盐耐受性实验

将产酸凝乳筛选出的菌株按2%（V/V）接种量接种于胆盐质量浓度分别为0.3 g/L、0.6 g/L、0.9 g/L、1.2 g/L的MRS液体培养基中，以不含胆盐的初始MRS液体培养基为对照，并以不接菌种的MRS培养基为空白对照，37 ℃厌氧培养16 h，测各组菌液的OD600nm值，按上式计算其生长率。

1.3.5 菌种PCR扩增及序列鉴定

筛选菌种的PCR扩增参考文献[10]。并将所得扩增产物送至北京睿博生物科技有限公司进行测序，测序结果经拼接后在美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源比对。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌计数及分离结果

通过计数结果显示，奶嚼口（XS-Z）中乳酸菌活菌数为（12.60±0.78）lg（CFU/mL），下层凝乳（XS-E）中乳酸菌活菌数为（12.31±0.35）lg（CFU/mL）。霍瑞等[11]通过对锡林郭勒盟地区售卖的29份奶嚼克样品进行乳酸菌计数表明，活菌数在4.90～7.30 lg（CFU/mL）之间。张哲等[12]对俄罗斯卡尔梅克地区酸奶油样品中乳酸菌多样性进行分析研究，结果显示其活菌数平均值为（8.12±0.46）lg（CFU/mL）。而本实验所采集的奶嚼口及下层凝乳中乳酸菌的活菌数均达到12.3 lg（CFU/mL）以上，远大于发酵奶油样品的平均水平，这可能是由于乳酸菌的活菌数量在很大程度上受到采样地区、采样季节以及自然发酵时间的影响。从样品中共分离获得200株乳酸菌。

2.2 菌株产酸、凝乳能力筛选结果

产酸能力是乳酸菌的重要特性，乳酸菌通过发酵鲜乳中的乳糖生成乳酸、乙酸、柠檬酸等有机酸，能够降低胃肠道pH，抑制肠道病原菌，调节肠道菌群平衡[13-15]。因此产酸是评价乳酸菌活力和筛选优良菌株的重要指标。凝乳是酸奶等乳制品生产的关键环节，在生产凝乳制品的过程中，多靠控制凝乳过程及性质来达到控制产品质构与风味特征的目的[16-17]。本实验参考食品国家安全标准发酵乳的理化指标及限量值设定筛选条件[18]：发酵8 h，酸度＞60°T，且凝乳效果较好的菌株为产酸凝乳优良的菌株。奶嚼口中菌株的产酸能力以及下层凝乳中产酸凝乳能力的筛选结果见图1、图2。

由图1、图2可知，酸度标记放大的散点即为满足筛选条件的菌株，其最终筛选结果见表1。由表1可知，奶嚼口样品中共筛选到12株具有较好产酸能力的菌株，其中菌株XS-Z-037、XS-Z-042、XS-Z-043、XS-Z-045、XS-Z-048 有少量乳清析出；下层凝乳样品中共筛选到7株产酸凝乳效果较好的菌株，其中菌株XS-E-001、XS-E-033、XS-E-099、XS-E-100有少量乳清析出。由此可知，奶嚼口样品中所分离的具有产酸凝乳能力的乳酸菌多于下层凝乳中所筛选的菌株。

图1 奶嚼口中菌株的产酸能力筛选Fig.1 Screening of acid production ability of strains in milk chew

图2 下层凝乳中菌株的产酸凝乳能力筛选Fig.2 Screening of acid production ability of strains in lower curd

表1 产酸凝乳菌株最终筛选结果Table 1 Final screening results of acid producing and curding strains

2.3 菌株耐酸性实验结果

将产酸凝乳筛选所得的19株乳酸菌进行耐酸性实验，结果见表2。由表2可知，当培养基pH值为5的条件下，奶嚼口样品中的菌株的平均生长率为（42.25±7.66）%，其最大生长率为50.76%；下层凝乳样品中的菌株平均生长率为（36.26±10.04）%，最大生长率为46.53%。所筛选的19株菌在pH值为2～4范围的酸性条件下，其生长率均＜5%，对酸性条件的耐受性较差。胃是人体重要的消化器官，正常胃液pH值在1.5～4.5之间，其强酸环境是阻碍大多数微生物进入肠道的重要屏障[19-20]。当胃液pH值为2.0时，几乎所有菌株都不能在其中繁殖生长，而当pH值为4.0时，不同属种来源的乳酸菌会表现出不同程度的耐受性[21]。如乳杆菌生长的pH范围为4.5～7.0，多数乳杆菌在pH值为4.0的条件下不能生长[22]。而本实验所筛选的19株菌对酸性条件的耐受性均较差，这可能是与菌株本身属种特性有关，还需进一步菌种鉴定验证。

表2 不同pH条件下耐酸性菌株筛选结果Table 2 Screening results of acid-resistant strains under different pH conditions

2.4 菌株耐胆盐实验结果

模拟人体小肠内胆盐的耐受性是筛选乳酸菌的基本标准之一，乳酸菌要想在肠道内定植发挥益生作用，必须能够耐受一定浓度的胆盐环境，而通常小肠内的胆盐浓度大约在0.03%～0.30%[23-24]。本实验将奶嚼口和下层凝乳样品中筛选得到的19株菌分别进行胆盐耐受性实验，结果见表3。由表3可知，随着胆盐质量浓度的升高，各菌株的生长率随之降低，其生长受到不同程度的抑制。奶嚼口样品中所筛选的菌株XS-Z-029、XS-Z-035、XS-Z-090在0.3 g/L的胆盐质量浓度下，其生长率分别为85.56%、87.56%、67.69%；其中菌株XS-Z-029、XS-Z-035在0.6 g/L的高胆盐质量浓度下，其生长率可达60.12%和63.02%，均表现出良好的耐受性。而下层凝乳样品筛选的菌株与奶嚼口相比对胆盐的耐受性较差，只有在0.3 g/L的胆盐质量浓度下有4株菌的生长率超过50%，分别为菌株XS-E-001（54.68%）、菌株XS-E-019（55.20%）、菌株XS-E-033（50.85%）、菌株XS-E-099（51.51%）。

表3 不同胆盐浓度下耐胆盐菌株筛选结果Table 3 Screening results of bile salt tolerant strains at different bile salt concentrations

2.5 菌种序列鉴定结果

将经产酸凝乳筛选得到的19株菌进行序列测序同源比对后，其结果见表4。由表4可知，奶嚼口样品经产酸凝乳筛选得到的12个单菌株经测序后，11株为乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis），1株为屎肠球菌（Enterococcu faecium），其同源相似性均达到97%以上。下层凝乳样品经产酸凝乳筛选得到的7个单菌株测序后均为乳酸乳球菌（L.lactis），且其同源相似性均为100%。霍瑞[11]从锡林郭勒地区采集的奶嚼克样品中分离鉴定出182株乳酸菌，分别隶属于乳球菌属（Lactococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、肠球菌属（Enterococcus）、链球菌属（Streptococcus）和明串珠菌属（Leuconostoc）5个属的14个种，其中乳酸乳球菌所占比重高达46.70%。旭日花[25]从内蒙古通辽牧区的酸奶、鲜奶和奶嚼口样本中分离得到61株乳酸菌，多数归属于乳球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、明串珠菌属和漫游球菌属（Vagococcus）。本实验筛选出的19株乳酸菌除菌株XS-Z-035为屎肠球菌（Enterococcu faecium），其余均为乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis），这与上述研究报道所鉴定的菌种属种相一致。通过对所筛选菌种的鉴定可知，奶嚼口和下层凝乳中乳酸菌种类之间并无明显差别。

表4 筛选菌株分子生物学鉴定结果Table 4 Identification results of molecular biology of screened strains

3 结论

本实验通过对奶嚼口和下层凝乳中乳酸菌种类和数量之间的比较分析可知，两者之间所含乳酸菌活菌数相近，从奶嚼口和下层凝乳中筛选出的19株乳酸菌除1株为屎肠球菌，其余18株均为乳酸乳球菌，菌株属种分类几乎没有区别。因此初步推断奶嚼口和下层凝乳由于来源于同一鲜奶的发酵产物，其乳酸菌种类和数量之间并无明显差别。所筛选的19株乳酸菌对酸性条件的耐受性均较差，奶嚼口样品中筛选出的乳酸菌较下层凝乳对胆盐的耐受性强，其中XS-Z-029和XS-Z-035 两株乳酸菌表现出较好的胆盐耐受性，具有潜在功能益生菌的开发的可能。