日本沼虾养殖过程中氨基脲存在特征研究

舒秀君，程 波，徐娟娟，熊贻伟，宋 蓓，宋 怿，韩 刚，蒋速飞

(1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院质量与标准研究中心，农业农村部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141； 3.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏无锡 214081)

日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)又名青虾或河虾，隶属十足目(Decapoda)长臂虾科(Palaemonidae)沼虾属(Macrobrachium)。在我国，日本沼虾广泛分布于江河、湖泊、池塘、河沟中，是我国淡水经济虾中的主要种类之一。随着日本沼虾在我国养殖和消费数量的增加，其产品的安全性也受到更多关注[1]。

氨基脲(Semicarbazide，SEM)是禁用药物呋喃西林的主要代谢产物之一[2]。目前，国内外均以检测SEM判断是否在养殖过程中非法使用呋喃西林，其中，欧盟和我国将动物源性食品中SEM残留的限量标准定为1.0 μg/kg[3，4]。研究表明，SEM来源广泛[2，5-11]，且SEM可能是甲壳类水产品中的内源性物质[12-16]，以SEM作为判定甲壳类水产品是否非法使用呋喃西林药物的监测指标并不合适[1，2，14-15，17-19]。有关甲壳类水产品中SEM的本底含量已有相关研究[1-2，4，18]，但大多限于个别样品普查，且仅限于甲壳和肌肉2种组织[2，10-11，14-15]，而养殖生长过程中甲壳类动物体内SEM的存在特征、动态变化过程鲜有报道，养殖产品中SEM的科学监管依据不足。因此，本实验以日本沼虾作为研究对象，测定池塘养殖日本沼虾不同生长时期SEM的存在特征与变化规律，以期为甲壳类水产品SEM限量标准的修订和产地水产品质量安全监督抽查的科学实施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、养殖条件与管理

实验于2018年7-9月在中国水产科学研究院淡水渔业研究中心大浦基地进行。随机选定其中一个池塘(面积32 000 m2，水深1.2 m)，2017年底在该池塘投放日本沼虾“太湖1号”亲虾，2018年5月开始自然繁殖并孵化出蚤状幼体，随后在池塘中自然生长。生产管理上，5月份蚤状幼体阶段主要采用泼洒豆浆等肥水方法培养轮虫等天然饵料；6月份大部分蚤状幼体变态为幼虾时，开始投喂日本沼虾0号颗粒饲料(南通正大)，每日2次；随着日本沼虾的生长，8月份改投喂日本沼虾1号颗粒饲料(江苏冠乾)，每日2次，养殖过程持续到9月底。养殖生产期间，不使用任何含呋喃西林成分药品。

1.2 实验设计

考虑日本沼虾组织取样的可行性，本研究以日本沼虾约达稚虾规格阶段开始作为起始点，将2018年7月1日采集的第一批日本沼虾定义为本研究初始，即0 d样品，陆续从养殖池塘每隔10 d拖网采集一次日本沼虾，依次类推定义为10、20、30、40、50、60、70 、80 d样品，样品采集过程覆盖日本沼虾幼虾至成虾的主要养殖生长阶段。每次采集约1 kg日本沼虾，共采集9个批次。样品采集后，在冷藏条件下6 h内运回实验室，并于当天随机选择30尾进行体长和体重测量。

所有样品用纯水冲洗干净后进行解剖，分别采集不同组织，其中前4次日本沼虾样品(即0～30 d)因个体较小，仅采集肌肉、甲壳和头胸部3种组织，后4次日本沼虾样品(即40～80 d)分别采集肌肉、甲壳、附肢、肝胰腺、鳃和眼柄6种组织。所采集的肌肉、甲壳、附肢和头胸部样品用粉碎机(九阳 JYL-C010)充分破碎，肝胰腺和鳃样品置于离心管中用剪刀充分剪碎，眼柄样品用研钵充分磨碎，分别制成均质样品后，在-20 ℃冷冻条件下保存待测。

1.3 SEM的测定

样品中SEM的测定采用参照农业部783号公告-1-2006《水产品中硝基呋喃类代谢物残留的测定液相色谱-串联质谱法》优化后的方法[20]，进行总SEM(游离态SEM和结合态SEM之和)和游离态SEM的含量测定。每个样品做3个平行样。池塘水体和养殖饲料经检测，均不含SEM成分。

1.4 方法检出限与质量控制

通过加标回收的方式，进行质量控制。根据SEM在日本沼虾各组织中的本底含量，添加水平为1.0～120 μg/kg。各组织中总SEM和游离SEM回收率在74.3%～113.5%之间，方法检出限为0.25 μg/kg(S/N≥3)，定量限为0.5 μg/kg(S/N≥10)。

1.5 数据统计及分析

2 结果与分析

2.1 不同生长时期日本沼虾的体重和体长

实验期间日本沼虾的平均体重和体长情况如图1所示。实验开始时，日本沼虾平均体重为(0.41±0.19)g，体长为(3.31±0.59)cm，随着养殖过程进行，体重和体长整体呈现增长趋势，且在第3～6次采样期间生长速度最快。实验后期，生长速度相对放缓。在最后一次采样时，日本沼虾的平均体重为(2.16±0.66)g，体长为(6.00±0.52)cm。

图1 实验期间日本沼虾体重和体长变化情况Fig.1 Variations of mean body weigth and mean body length of M.nipponense during the experiment

2.2 不同生长时期日本沼虾各组织中总SEM含量水平及分布特征分析

不同生长时期日本沼虾各组织中总SEM含量结果见表1。由表1可见，日本沼虾在80 d养殖不同采样时期内，肌肉中均存在总SEM，含量范围为(6.88±0.15)～(17.11±0.62)μg/kg。随着生长过程进行，肌肉中总SEM含量逐渐降低，从初始最高值(17.11±0.62)μg/kg降低至70 d时最低值(6.88±0.15)μg/kg，在第80 d含量略有回升。甲壳中均存在总SEM，含量范围为(107.30±1.10)～(306.09±8.69)μg/kg。随着生长过程进行，甲壳中总SEM含量呈现总体上升局部下降的变化趋势，实验前10 d内降低至最低值(107.30±1.10)μg/kg，随后逐渐升高，在第30 d波动较大，40～80 d持续上升并在80 d达最大值。实验期间前30 d内头胸部中均存在总SEM，含量范围为(100.29±1.21)～(116.15±2.67)μg/kg，波动幅度较小。第40～80 d内，附肢、眼柄、鳃和肝胰腺中均存在总SEM，其中，附肢中含量范围为(243.90±8.55)～(532.31±26.27)μg/kg，随着养殖过程进行，含量逐渐增加并在80/表示无样品。

表1 不同生长时期日本沼虾中总SEM的含量水平Tab.1 Concentration of total SEM in M.nipponense of different growth stages

d达最大值；眼柄中含量范围为(85.27±3.19)～(122.82±2.60)μg/kg，随着养殖过程进行，含量呈现整体增加局部波动的变化趋势；鳃中含量范围为(48.43±2.13)～(85.60±1.33)μg/kg，随着养殖过程的进行，含量在第60 d时小幅增加，70 d时明显下降并达到最小值，80 d时又明显上升并达最大值；肝胰腺中含量范围为(13.51±1.15)～(25.94 ±1.78)μg/kg，随着养殖过程进行，在40～60 d期间肝胰腺中总SEM含量逐渐增加，在70 d时下降并达到最小值，80 d时又明显增加。

由表1可知，在0～30 d内，甲壳、头胸部和肌肉中总SEM的平均含量分别为(174.04±57.04)、(109.86±6.68)和(15.56±1.79)μg/kg，日本沼虾幼虾各组织中总SEM呈现：甲壳>头胸部>肌肉的含量分布特征。在40～80 d内，附肢、甲壳、眼柄、鳃、肝胰腺和肌肉中总SEM的平均含量分别为(377.16±102.09)、(249.36±42.56)、(97.03±14.18)、(59.86±14.66)、(20.39±4.87)和(9.67±1.58)μg/kg，日本沼虾成虾各组织中总SEM呈现：附肢>甲壳>眼柄>鳃>肝胰腺>肌肉的含量分布特征。

2.3 日本沼虾各组织中SEM的存在形态

如图2所示，不同生长时期日本沼虾肌肉和肝胰腺中SEM主要以游离态形式存在，游离态SEM在肌肉中所占比例为45.84%～83.51%，在肝胰腺中所占比例为56.99%～92.47%。甲壳、眼柄、附肢、头胸部和鳃等组织中SEM主要以结合态形式存在，结合态SEM在甲壳中所占比例为85.01%～92.79%；在眼柄中所占比例为85.36%～90.34%；在附肢中所占比 例为83.55%～89.79%；在头胸部中所占比例为75.46%～88.40%；在鳃中所占比例为68.01%～78.29%。

图2 不同生长时期养殖日本沼虾各组织的SEM形态组成Fig.2 SEM composition of tissues of cultured M.nipponense from different growth stages

3 讨论

3.1 不同生长时期日本沼虾中SEM的含量水平及其变化特征

水产品中SEM残留通常认为是在养殖过程中非法使用呋喃西林后代谢产生。本研究结果显示，养殖过程不同时期日本沼虾中均检出SEM，且含量均超过我国限量要求(1.0 μg/kg)。养殖过程中无人为使用硝基呋喃类禁用药物的行为，池塘水体和所用饲料经检测均不含SEM成分，但日本沼虾中SEM含量超标，这与前人研究结果一致[2,4,14-15,18,20]。

本研究中日本沼虾肌肉、甲壳和头胸部总SEM的含量范围与于慧娟等[2]和Hui等[1]研究结果一致，但与王鼎南等[4]和宋蓓等[20]结果有所差异，可能与不同研究所采集样本处于不同生长时期有关。日本沼虾在养殖过程中具有不断繁殖的生物学特性，在不同时间点采样，采集到不同批次孵化日本沼虾的可能性较大，从而对实验结果存在一定影响。随着养殖过程的进行，日本沼虾各组织中总SEM含量变化无明显规律。其中，肌肉中总SEM含量逐渐降低，且在20～50 d之间降低速度最快，可能与日本沼虾肌肉生长有关。在此期间日本沼虾体重增长最快，而体重增长最主要贡献来自于肌肉增长，导致SEM含量被“稀释”而降低。甲壳中总SEM含量逐渐增加，并在40 d时明显降低，这可能与日本沼虾蜕皮过程有关。在此期间日本沼虾体重和体长增长最快，而日本沼虾的生长必然伴随蜕皮过程，但甲壳中SEM是否会随着蜕皮而排出体外，或SEM在蜕皮过程中是否发挥了某种生物学作用，值得进一步研究。附肢中总SEM含量在实验40～80 d期间变化规律与甲壳中变化规律较为一致，可能与附肢主要由甲壳和肌肉组成，而甲壳中含量远高于肌肉，因此，甲壳中SEM含量变化特征主导了附肢中SEM含量变化的结果。

3.2 不同生长时期养殖日本沼虾中SEM的含量分布特征与存在形态

在实验0～30 d内，养殖日本沼虾幼虾各组织中总SEM呈现：甲壳>头胸部>肌肉的含量分布特征，这与Hui等[1]的研究结果一致。在实验40～80 d内，养殖日本沼虾成虾各组织中总SEM呈现：附肢>甲壳>眼柄>鳃>肝胰腺>肌肉的含量分布特征，附肢中总SEM平均含量最高，这与课题组前期探索研究不一致[20]。按照结构组成，附肢主要由甲壳和肌肉等组成，总SEM在附肢中的含量应介于甲壳和肌肉之间，为何附肢中含量最高，有待进一步深入研究。彭婕等[21]对中华绒螯蟹不同组织中SEM进行分析，发现除蟹壳外，肌肉、肝胰腺、鳃及性腺中均无SEM检出。于慧娟等[2]对三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、锯缘青蟹(Scyllaserrata)、珍宝蟹(DungenessCrab)、中国鲎(Tachypleustridentatus)等甲壳类动物的研究中，也仅在甲壳中检测出不同含量SEM成分。可见，SEM在不同甲壳动物中分布特征不同，但甲壳均是SEM存在与含量较高的组织。

在形态组成上，SEM在日本沼虾肌肉和肝胰腺中主要以游离态形式存在，游离态SEM所占平均比例分别为67.35%和72.40%，在甲壳、眼柄、附肢、头胸部和鳃中主要以结合态形式存在，结合态SEM所占平均比例分别为89.50%、87.16%、85.68%、80.48%和73.30%。肌肉和甲壳中SEM的存在形态与王鼎南等[4]和Christof等[14]的研究结果一致，而眼柄、附肢、头胸部和鳃等组织，此为第一次报道，缺乏可比较研究。另外，由于日本沼虾肌肉中SEM含量相较其他组织含量最低，且主要以游离态形式存在，本研究选择了前期研究[20]优化的SEM检测方法，通过测量含量相对较高的游离态SEM方法，而非直接检测含量处于检测限的结合态SEM，从而进行SEM形态分析，最大程度避免了因检测含量低导致检测误差或检不出的问题。