石家庄地区已知HLA型别单采血小板捐献者基因资料库库容评价*

苏蔓 李茵 赵倩 胡光磊 王振雷 何路军

反复输血或输注血小板的患者可产生血小板同种抗体，血小板同种抗体包括红细胞抗原（ABH）抗体、人类血小板抗原（human platelet antigen，HPA）抗体和人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）抗体。同种抗体的产生是导致免疫性血小板输注无效（platelet transfusion refractoriness，PTR）的原因。血小板表面仅表达HLA-I类抗原，未发现HLA-Ⅱ类抗原，HLA-I类抗原是重要的血小板相关抗原，同种免疫产生抗HLA-I类抗体是造成免疫性PTR的最常见因素（约占免疫因素的80%），占所有病因的11.7%[1]。血小板表面表达的HLA-I类抗原以HLA-A和HLA-B抗原为主，HLA-C抗原仅有少量表达。本研究采用聚合酶链反应-序列特异引物（PCR-SSP）和聚合酶链反应-直接测序分型（PCR-SBT）方法对1 935名石家庄地区单采血小板捐献者HLA-I类基因A、B位点进行分型，并建立血小板捐献者基因资料库，分析捐献者基因资料库HLA-A、HLA-B基因及单体型分布特点，现将研究结果报告如下。

材料与方法

1 标本来源 石家庄地区无血缘关系固定单采（机采）血小板捐献者1 935名，告知其试验目的，其知情同意并自愿加入本地区血小板捐献者基因资料库，留取EDTA抗凝静脉血5 mL/人。

2 DNA提取 采用TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，北京）进行DNA提取，PCR扩增前将浓度调整至（30～70） ng/μL。

3 HLA基因分型 HLA基因分型采用聚合酶链反应-序列特异引物（PCR-SSP）方法（TBG生物科技有限公司，台湾）和聚合酶链反应-直接测序分型（PCRSBT）方法（北京诺诗康瀛基因技术股份有限公司，北京），利用Arlequin（V3.5.1.3）软件进行HLA单倍型统计。

4 统计学处理 HLA-A、B位点基因频率（Gene Frequency，GF）GF=C/2N，C：具有某抗原的个体数，N：调查样本的群体总数。

5 血小板捐献者基因资料库最小规模评价 假设有95%的把握在捐献者基因资料库中检测到该单体型，采用单体型频率(HF)估算捐献者基因资料库规模，N= –1.301 0/lg(1-2HF+HF2)，其中N为血小板捐献者基因资料库所需的最少人数，HF为单体型频率[2]。

6 石家庄地区单采血小板捐献者CREG表型频率统计按照CREG（cross-reactive Groups，交叉反应组）表，CREG基因频率为其对应HLA-A、B抗原特异性表位基因频率之和[3]。

7 石家庄地区单采血小板捐献者CREG不配合概率 石家庄地区单采血小板捐献者CREG不配合概率（P）：P=2xy(1-xy)，x和y为CREG基因频率[3]。

结 果

1 石家庄地区单采血小板捐献者HLA-I基因频率分析1 935位无血缘关系的血小板捐献者中共检出HLA-A位点抗原特异性19种，其中频率最高的前5位抗原依次为A2（0.313 4）、A11（0.158 4）、A24（0.157 9）、A30（0.068 7）、A33（0.061 0），见表1；检出HLA-B 位点抗原特异性40种，频率最高的前5位抗原依次为B13（0.118 1）、B61（0.086 3）、B51（0.078 8）、B62（0.071 1）、B46（0.064 6），见表2；观察到HLA-A-B单体型355种，频率大于0.01的共28种，其中频率最高的为A2-B13（0.044 4）和A2-B62（0.029 5），见表3。

2 石家庄地区血小板捐献者基因资料库最小规模评价如果按照单体型频率HF=0.01估算血小板捐献者基因资料库最少规模N=150人，石家庄地区单采血小板捐献者中HF＞0.01的所有单体型频率之和为0.481 2，即一个150人的捐献者基因资料库仅有48.12%的患者有95%的可能性找到至少1例HLA相合的供者；如果按照单体型频率HF=0.001估算捐献者基因资料库规模N=1 500人，石家庄地区单采血小板捐献者中HF＞0.001的所有单体型频率之和为0.931 8，即一个1 500人的捐献者基因资料库有93.18%的患者有95%的可能性找到至少1例HLA相合的供者。

表1 石家庄地区血小板捐献者HLA-A基因频率（n=1 935）

表2 石家庄地区血小板捐献者HLA- B基因频率（n=1 935）

表3 石家庄地区血小板捐献者常见HLA-A-B单体型频率

3 石家庄地区单采血小板捐献者CREG表型频率及不配合概率 石家庄地区单采血小板捐献者中HLA-A位点的1C、2C和HLA-B位点的5C、7C、12C基因频率均较高，见表4。石家庄地区单采血小板捐献者A-A抗原CREG表位1C与2C发生不配合的概率最高，达到0.300 2；B-B抗原CREG表位7C与5C发生不配合的概率最高，为0.308 7；Broad-CREG中4C与6C的不配合概率为0.451 1，见表5。

表4 石家庄地区血小板捐献者HLA-A和B抗原CREGs基因频率(n=1 935)

表5 石家庄地区血小板捐献者CREG表位不配合概率

讨 论

血小板输注通常用于预防和治疗患者血小板减少或血小板功能缺失引起的出血，是临床上重要的支持疗法[4]。PTR是指患者在接受连续2次足够剂量的血小板输注后，临床出血未见改善，血小板计数没有明显增高，有时反而下降[5]。造成PTR的原因通常有以下3种：血小板本身质量、非免疫因素以及免疫因素。非免疫因素一般是指消耗性凝血、脾肿大、败血症等，免疫因素是指患者体内产生了血小板同种抗体[6]。HLA具有丰富的遗传多态性且抗原性较强，有研究表明，反复输注血小板的患者约有50%～70%可产生HLA抗体[7]，且抗体阳性率与患者输血的次数成正比[8]。HLA抗体是引起免疫性PTR的主要原因，有研究报道引起免疫性PTR的抗体中，单独的HLA抗体占80%～90%，HPA抗体约占5%～10%，HLA/HPA复合抗

体约占10%～15%[9]。任明等[10]对115例血小板抗体筛查阳性的反复输血的血液病患者进行抗体特异性检测发现抗HLA-I类抗体阳性率更是高达97. 39%。

按照《临床输血技术规范》要求，目前我国临床单采血小板输注仅需ABO同型即可输注，尚未将HLA相合纳入硬性要求。许多HLA抗原因分子结构相近，而可与某一抗体存在不同程度的交叉反应，这些抗原被称为交叉反应组（CREG）。患者随机输注血小板制品会接受与其自身不同的HLA-A、B抗原免疫，不但会产生针对单特异性抗原表位的抗体，也会产生CREG抗体，CREG抗体的产生同样是导致PTR的原因之一[3]。在HLA配合性输注血小板供者选择中，当找不到与受者HLA抗原完全一致的血小板供者时，可以根据HLA的交叉反应性来筛选供者[11]。有研究表明，除A级（HLA-A、B位点4个抗原均匹配）和Bu级（HLA-A、B位点4个抗原中3个抗原匹配，1个抗原未知或空缺）相合外，Bx级（HLA-A、B位点2～3个抗原匹配，其余为CREG抗原）相合的血小板也能达到较好的输注效果，故了解本地区单采血小板捐献者CREGs基因频率及表位不配合率对供者的选择和减少因CREG抗原免疫产生CREG抗体所导致的PTR具有重要意义。本研究计算了石家庄地区单采血小板捐献者CREG表型频率并推导出CREG表位的不配合概率，发现A-A抗原CREG表位的1C与2C、B-B抗原CREG表位的7C与5C以及Broad CREG的4C与6C的不配合概率均较高，在临床血小板输注时选择供者以避免因CREG抗原免疫产生CREG抗体所导致的PTR中应予以关注。

如要有效避免免疫性PTR的发生则需进行血小板HLA同型输注，对于临床已经出现PTR的患者，采取HLA同型输注也可以明显改善输注效果，或者为已产生HLA抗体的患者通过血清学血小板特殊配血实验筛选无该患者HLA抗体相应抗原交叉配型相合的单采血小板[12]。Moroff等[13]研究表明输注HLA A级和Bu级相合的血小板效果优于输注仅交叉配型相合的血小板。要实现HLA同型输注就需要建立一个本地化已知HLA型别的血小板捐献者基因资料库。一个血小板捐献者基因资料库究竟需要库容多少才能满足临床需求？从理论上讲，捐献者基因资料库库容越大患者找到相合供者的概率越高，但无限增加库容会导致建库成本提高。HLA在人群中分布特征因人种、遗传背景不同而不同，Takahashi研究认为理论上在日本一个5 000人的血小板捐献者基因资料库中80%的患者可以找到5个HLA完全相合的供者，而高加索人和北美人群如达到这一要求则可能分别需要18 000和25 000人的捐献者基因资料库[14]，因此血小板捐献者基因资料库的建立应根据当地人群HLA分布情况来确定建库规模[15]。我们根据本研究实验数据对石家庄地区血小板捐献者基因资料库最小规模评价后，认为如果库容为150人，在石家庄地区一个150人的捐献者基因资料库中仅有48.12%的患者有95%的可能性找到至少1名HLA相合的供者；如果建库规模扩大为1 500人，则有93.18%的患者有95%的可能性找到至少1名HLA相合的供者。因此，理论上我们目前1 935人的血小板捐献者基因资料库基本上可以满足石家庄地区血小板输注无效患者找到HLA相合供者的需求。但是结合血小板输注ABO同型的要求，同时有10%左右的免疫性PTR由血小板特异性抗体（HPA）导致，戴宇东[16]的研究结果表明中国汉族人群单采血小板供者HPA分型单库容600人的捐献者基因资料库可有75%患者有95%的可能性找到至少1名ABO和HPA-1～16系统完全相同的供者。如考虑ABO、HLA、HPA均相合，仍需适当增加库容量，以满足石家庄地区患者的需求。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突