长链非编码RNA HOTAIR在卵巢上皮癌组织中的表达及与E-cadherin表达的相关性及其临床意义

牛荔，柳英兰

(哈尔滨医科大学附属第一医院妇科，哈尔滨 150001)

卵巢上皮癌是中老年女性常见的恶性肿瘤之一，其死亡率居妇科肿瘤的首位。近年来其发病率呈逐渐上升趋势，严重威胁女性健康[1]。虽然诊疗技术不断进步，但卵巢上皮癌的5年生存率仍无明显提高[2]。卵巢上皮癌的发病原因目前尚不明确，很多因素参与其中，其在发现时多为晚期。早期卵巢上皮癌的首选治疗方法为手术治疗，晚期卵巢上皮癌辅助静脉化疗、腹腔灌注化疗、腹腔热灌注治疗和联合治疗等[3]。然而，积极的治疗措施并没有有效避免卵巢上皮癌的复发和转移，卵巢上皮癌患者的5年生存率仍未超过30%[4]，而靶基因治疗方式有望成为卵巢上皮癌治疗的新选择[5]。因此，积极寻找卵巢上皮癌的肿瘤标志物，对于早期发现卵巢上皮癌至关重要。HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是第一个被发现具有反式转录调控作用的长链非编码RNA，是一种功能性的RNA分子，通过一系列蛋白复合物调控其他基因的表达和功能，其过表达与多种肿瘤细胞的侵袭、凋亡、耐药等某些特定的生物学行为密切相关[6]。研究表明，HOTAIR在多种人体肿瘤中存在过表达[7-8]。β联蛋白(β-catenin)是一种胞内核蛋白，多在细胞的胞膜上表达[9]。上皮钙黏素(E-cadherin)是一种重要的黏附分子，其表达增加或E-cadherin自身功能变化均可使β-catenin自细胞膜进入细胞质或细胞核，活化靶基因促进细胞增殖黏附，从而导致肿瘤的发生发展[10]。本研究旨在探讨长链非编码RNA HOTAIR在卵巢上皮癌组织中的表达与E-cadherin表达的相关性及其临床意义，并探讨HOTAIR在卵巢上皮癌发生、发展中的作用，以寻找卵巢上皮癌新的肿瘤标志物。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集2015年1月至2018年12月在哈尔滨医科大学附属第一医院经手术治疗的45例卵巢上皮癌患者术中的新鲜组织标本，术后经病理证实浆液性卵巢上皮癌30例、黏液性卵巢上皮癌15例。年龄29～67岁，平均(43±7)岁。其中，卵巢上皮癌患者血清糖类抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)>200 kU/L 18例(浆液性卵巢上皮癌10例、黏液性卵巢上皮癌8例)，血清CA125≤200 kU/L 27例(浆液性卵巢上皮癌20例、黏液性卵巢上皮癌7例)。按照国际妇产科联盟的分期标准[11]：Ⅰ～Ⅱ 期26例(浆液性卵巢上皮癌19例、黏液性卵巢上皮癌7例)，Ⅲ～Ⅳ期19例(浆液性卵巢上皮癌11例、黏液性卵巢上皮癌8例)。病理组织学分化程度：高分化11例(浆液性卵巢上皮癌5例、黏液性卵巢上皮癌6例)，中分化26例(浆液性卵巢上皮癌20例、黏液性卵巢上皮癌6例)，低分化8例(浆液性卵巢上皮癌5例、黏液性卵巢上皮癌3例)。另收集45例癌旁组织和手术治疗后经病理证实的45例良性卵巢上皮肿瘤组织及正常卵巢组织45例作为对照组。本研究经哈尔滨医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2试剂和方法

1.2.1HOTAIR信使RNA(mRNA)表达的检测 采用相对定量反转录聚合酶链反应法将卵巢上皮癌组织、癌旁组织、良性卵巢上皮肿瘤组织及正常卵巢组织置于液氮中速冻，-80 ℃冰箱保存。取冻存的组织约100 mg，室温下解冻，采用Trizol法提取组织总RNA，经紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格。按反转录试剂盒说明检测各组织中HOTAIR基因的mRNA表达水平：聚合酶链反应体系为25 μL，含互补DNA模板1 μL，2×耐热DNA聚合酶(Taq酶)混合物11 μL、上下游引物各1 μL。RNA游离水11 μL。

根据基因库(Gene Bank)中HOTAIR基因序列(编号：NR_047517.1)，设计HOTAIR基因引物，引物序列:上游引物5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游引物5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；(引物大小258 bp)；内参照β肌动蛋白基因序列上游引物 5′-GATGACCCAGATCATGTTTG-3′,下游引物5′-TGGAGTTGAAGGTAGTTTCC-3′(引物大小420 bp)；引物及其合成产物的正确性均在NCBI网站进行BLAST验证(网址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，均由上海生工生物工程技术服务公司合成。

反应条件：预变性94 ℃ 5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃复性30 s；72 ℃延伸30 s；共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。聚合酶链反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统观察并分析结果。应用Image-ProPlus 6.0软件(美国Media Cybernetics公司开发)分析目的基因HOTAIR mRNA条带的灰度值，以β肌动蛋白为内参，计算各组织转染前后HOTAIR mRNA相对表达水平的变化。实验重复3次，取平均值。有表达者为阳性，无表达者记为阴性，HOTAIR mRNA在不同组织中的阳性表达率(%)=阳性表达例数/全部例数×100%[12]。

1.2.2E-cadherin蛋白表达的检测 采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法检测组织标本中的E-cadherin蛋白表达。一抗采用兔抗人E-cadherin多克隆抗体(美国Abcam公司生产)，抗体稀释比例为1∶200。按照链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结检测试剂盒说明书进行操作。阴性对照组的一抗采用磷酸盐缓冲液。

观察各个标本，如在细胞核或细胞质出现黄染或棕褐色颗粒记为阳性细胞。每个标本均筛选10个含有阳性细胞的高倍视野(200×)，根据每份标本中阳性的染色强度和阳性细胞所占百分比进行评分。染色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，深黄色或棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞所占百分比评分：无阳性细胞计0分，≤25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分；染色强度与阳性细胞百分比的乘积，0分为阴性，1～4分为弱阳性，5～8分为中度阳性，9～12分为强阳性，将阴性与弱阳性归为一组，视为阴性表达，其余为阳性表达[13]。计算各组织中E-cadherin的阳性表达率。

2 结 果

2.1HOTAIR mRNA在不同组织中的表达 在阳性表达的组织中，HOTAIR基因在258 bp水平有扩增条带，阴性表达者无扩增条带显示(图1)。在卵巢上皮癌组织中，HOTAIR mRNA的相对表达量为4.3±1.7，在癌旁组织中相对表达量为0.9±2.2，在良性卵巢上皮肿瘤组织及正常卵巢组织中相对表达量均为0，不同组织间比较差异有统计学意义(F=65.838，P<0.001)。

M：标准带；1：浆液性卵巢上皮癌；2：黏液性卵巢上皮癌；3：癌旁组织；4：良性卵巢上皮肿瘤组织；5：正常卵巢组织；HOTAIR：HOX转录反义RNA；mRNA：信使RNA

图 1 不同组织中HOTAIR mRNA的表达

HOTAIR mRNA在不同组织中的阳性率比较差异有统计学意义(χ2=112.380，P<0.001)。其中，卵巢上皮癌组织HOTAIR mRNA的阳性率高于癌旁组织、良性卵巢肿瘤组织和正常卵巢组织(χ2=40.020，P<0.001；χ2=62.830，P<0.001；χ2=62.830，P<0.001)，癌旁组织的阳性率高于良性卵巢肿瘤组织和正常卵巢组织(χ2=7.590，P=0.012；χ2=7.590，P=0.012)，良性卵巢肿瘤组织与正常卵巢组织的阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2E-cadherin蛋白在不同组织中的表达 E-cadherin蛋白主要在细胞质中表达，其在卵巢上皮癌组织中呈深黄色或棕黄色；在癌旁组织中部分表达呈浅黄色，部分无着色；在卵巢良性肿瘤组织中略有淡黄色表达，在正常卵巢组织中无着色，见图2。E-cadherin蛋白在不同组织中的阳性率比较差异有统计学意义(χ2=107.955，P<0.001)。其中，卵巢上皮癌组织E-cadherin蛋白的阳性率高于癌旁组织、良性卵巢肿瘤组织和正常卵巢组织(χ2=37.452，P<0.001；χ2=61.946，P<0.001；χ2=65.769，P<0.001)，癌旁组织的阳性率高于良性卵巢肿瘤组织和正常卵巢组织(χ2=7.200，P=0.015；χ2=10.000，P=0.003)，良性卵巢肿瘤组织与正常卵巢组织的阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 HOTAIR mRNA和E-cadherin蛋白在不同组织中的表达率 [n=45，例(%)]

HOTAIR：HOX转录反义RNA；E-cadherin：上皮钙黏素

2.3HOTAIR mRNA的表达与卵巢上皮癌临床病理特征的关系 见表2。不同年龄、肿瘤大小、病理类型、有无腹水形成、有无淋巴结转移的HOTAIR mRNA阳性率和相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)；低分化组织的HOTAIR mRNA阳性率和相对表达量高于中分化和高分化组织，Ⅲ～Ⅳ期患者的阳性率和相对表达量高于Ⅰ～Ⅱ期，血清CA125>200 kU/L患者的阳性率和相对表达量高于血清CA125≤200 kU/L患者(P<0.05)。

2a：浆液性卵巢上皮癌组织；2b：黏液性卵巢上皮癌组织；2c：癌旁组织；2d：良性卵巢上皮肿瘤组织；2e：正常卵巢组织；E-cadherin：上皮钙黏素

表2 HOTAIR mRNA的表达与卵巢上皮癌临床病理特征的关系

HOTAIR：HOX转录反义RNA；CA125：糖类抗原125；a为F值，余为t值

2.4卵巢上皮癌组织中HOTAIR与E-cadherin表达的相关性 Spearman等级相关分析结果显示，HOTAIR mRNA与E-cadherin蛋白在卵巢上皮癌组织中的表达呈正相关(rs=0.615，P<0.001)。

3 讨 论

卵巢上皮癌发生隐匿，发现时多为晚期。因此，寻找更多有效的肿瘤标志物，有利于从多方面对卵巢上皮癌的诊断进行评价。卵巢上皮癌的发生与发展是多种基因和多因素的复杂调节过程，如DNA的损伤修复、多个信号通路激活与抑制、细胞凋亡的削弱[14]。HOTAIR是一种常见的人类长链非编码RNA，其长度超过200个核普酸序列，位于细胞核或胞质内，通过一系列蛋白复合物来实现其生理功能[15]。HOTAIR过表达与多种生物学行为密切相关，并可通过激活多种信号通路广泛参与多种肿瘤细胞的发生与发展[16]。有文献报道，HOTAIR可作为一种肿瘤标志物参与肝癌的早期诊断[17]。本研究结果显示，HOTAIR mRNA在卵巢上皮癌组织中高表达，在正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤中几乎不表达，而在癌旁组织中有少量表达，提示其可以区分良恶性，具有卵巢上皮癌肿瘤标志物的候选基因潜能，可作为分子治疗的靶基因。但其在癌旁组织中少量表达的机制有待进一步研究。本研究中，HOTAIR mRNA在浆液性和黏液性卵巢上皮癌组织中的表达水平差异无统计学意义，而与临床分期和组织学分类密切相关，随着临床分期的增加，HOTAIR mRNA在Ⅲ～Ⅳ期中的表达高于Ⅰ～Ⅱ期；在不同的组织学分类中，HOTAIR mRNA在低分化组织中的表达多于中分化及高分化组织，说明HOTAIR与卵巢上皮癌的恶性程度密切相关。有文献报道，通过腺载体增加HOTAIR的表达，可以明显促进膀胱上皮癌细胞的增殖；而通过小分子RNA抑制HOTAIR基因的表达，可以明显抑制肿瘤细胞侵袭和生长能力[18]。本研究提示，HOTAIR mRNA在上皮来源的卵巢癌细胞中过表达，这为进一步研究其是否可以促进卵巢上皮癌细胞的增殖提供了依据。

E-cadherin蛋白是介导细胞间相互聚集的黏附分子家族成员之一，对同种细胞黏附起调节作用，维持上皮细胞形态和结构的完整[19]。有研究显示，E-cadherin 蛋白表达增加与β-catenin结合，激活Wnt/β-catenin信号通路，参与肿瘤的发生与发展[20]。同时该研究发现，乳腺癌、肾癌、膀胱癌、子宫内膜癌等上皮来源的肿瘤组织中均存在E-cadherin蛋白的异常表达，从而导致相关信号通路的激活。本研究结果显示，E-cadherin蛋白在卵巢上皮癌组织中表达阳性率高，在癌旁组织中少量阳性表达，在卵巢良性肿瘤组织中极少量阳性表达，在正常卵巢组织中无表达，提示E-cadherin蛋白表达增多可促进Wnt/β-catenin信号通路参与卵巢上皮癌的发生发展。也有文献报道，抑制或增强E-cadherin基因的表达可以调控小细胞肺癌细胞的增殖和黏附[21]。因此，可以通过RNA干扰技术研究相应的E-cadherin分子治疗药物，有效抑制卵巢上皮癌的增殖和黏附。

肿瘤细胞的侵袭和转移是影响肿瘤进展的重要步骤，也是肿瘤病情发展的关键，其机制涉及各种基因参与，并与肿瘤的恶性程度密切相关[22]。本研究结果显示，卵巢上皮癌组织中HOTAIR与临床分期密切相关，提示卵巢上皮癌组织中HTOAIR表达增加的同时，也参与了调节肿瘤细胞的侵袭和转移；HOTAIR mRNA在卵巢上皮癌中的表达与E-cadherin蛋白的表达呈正相关，提示HOTAIR可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，从而起到影响卵巢上皮癌发展的作用，两者对卵巢上皮癌的黏附和侵袭发挥密切协同作用。此外，HOTAIR mRNA在有无淋巴结转移和有无腹水方面差异均无统计学意义(P>0.05)，提示HOTAIR可能参与卵巢上皮癌的侵袭和转移过程的初级阶段。

综上可知，HOTAIR在卵巢上皮癌中表达显著增加，其与E-cadherin的表达呈正相关，两者协同参与了卵巢上皮癌的侵袭和转移，可作为临床较为理想的卵巢上皮癌的生物学标志物。