镁表面载地塞米松DNA凝胶促成骨细胞分化研究

闫宁 宋文 李哲 张玉梅

金属镁由于其良好的生物相容性和生物可降解性，可以弥补常规不可吸收引导骨再生(GBR)屏障膜需二次手术取出的不足，以及可吸收膜机械性能差的缺点[1-2]。然而镁表面成骨诱导能力不足，用镁膜作为GBR膜难以发挥足够的引导作用[3]。大量研究在镁表面加载生物活性涂层或者活性药物、因子提高诱导成骨作用，增强GBR膜材料成骨效能[4]。地塞米松(DEX)是一种常用作体外诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的抗炎糖皮质激素，具有诱导细胞碱性磷酸酶(ALP)表达的能力[5]，近年来热门的DNA水凝胶在生物相容性优异，有着良好的药物负载能力，可以作为药物的输送载体[6]。本研究在镁表面加载含有DEX的DNA水凝胶涂层，提升镁表面成骨诱导能力。

1 材料与方法

1.1主要材料、试剂与仪器

方形纯镁片(边长1 cm，广州镁业);碳化硅砂纸400～3 000 目(勇士,德国); 丙酮、无水乙醇、氢氧化钠(北京国药)；鲑鱼精DNA、地塞米松、4%多聚甲醛(北京索莱宝)；纳米硅酸盐(nSi，Laponite XLG，Nanocor，美国)；成骨细胞前体细胞MC3T3-E1 (ATCC，美国)，ɑ-MEM培养基、胎牛血清(Hyclone，美国)；CCK-8试剂盒(上海七海生物)；BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试剂盒、ALP定量试剂盒(北京碧云天)；Prime ScriptTMRT Mater Mix、TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Takara，日本)。

阳极氧化电源(香港龙威)；全波长酶标仪(BioTek，美国)；涡旋混匀仪主动(广州科适特)；冷冻干燥机(SIM，美国)；场发射扫描电镜(Hitachi，日本)；CFX96实时荧光定量 PCR仪 (Bio-Rad，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 镁基底的预处理 对纯镁片依次使用400～3 000 目的砂纸逐级打磨抛光，并依次在丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗。在电解液为120 g/L的NaOH溶液中进行恒定电压40 V，时间为1 h的阳极氧化反应，后进行450 ℃、恒温6 h的退火处理。

1.2.2 DNA凝胶的制备 将鲑鱼精DNA常温溶解于超纯水中，制备成浓度为4%w/v的DNA溶液，37 ℃恒温保持2 d，使其充分溶解，后将DNA溶液加热至90 ℃， 1 min后置于37 ℃环境下冷却2 h来形成预凝胶。将纳米硅酸盐(nanosilcate,nSi)与DEX分散体混合添加至DNA预凝胶中，混合涡旋5 min，使nSi与DEX终浓度达到0.5%与0.5 mg/ml。各取200 μl混合物均匀滴加在预处理的镁基底表面， 37 ℃过夜以完全凝胶化。使用扫描电镜观测冷冻干燥表面喷金后的DNA预凝胶与添加nSi的DNA终凝胶表面形貌，以及复合材料纵切后的截面形貌。

1.2.3 地塞米松释放 用 PBS配置含有不同DEX浓度(0.01、 0.05、 0.1、 0.5、 1.0 mg/ml)的标准液，检测240 nm波长的吸光度，线性拟合出DEX浓度的标准曲线。将涂覆有200 μl的0.5 mg/ml DEX浓度的DNA预凝胶与终凝胶装入15 cm透析袋中，两端密封后，浸入50 ml PBS溶液的离心管中， 37 ℃恒温振荡，在第1～15 天内每天取 1 ml透析液，测量240 nm波长处的吸光度，计算DEX释放量与总释放比率，后补充等量 PBS，整个实验持续到释放水平达到稳定。

1.2.4 细胞培养 实验细胞选择为小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞，以4×104个/ml的细胞密度接种在12 孔Transwell小室的下室，培养基为10% FBS的α-MEM培养基，隔日换液。各组材料置于上室，在5% CO2孵箱中， 37 ℃条件下恒温培养。

1.2.5 CCK-8测定细胞毒性 细胞培养后的第3 天用 PBS 漂洗下室细胞，每孔加入550 μl CCK-8检测混合液，置于37 ℃条件下恒温孵育3 h后取出，用分光光度计测定450 nm波长处的吸光度，计算平均值。

1.2.6 ALP染色和定量分析 细胞培养24 h后更换为成骨诱导培养液，每2 d换液。在成骨诱导7 d后，PBS漂洗下室细胞3 次后， 4%多聚甲醛固定20 min，使用BCIP/NBT显色试剂盒进行染色，避光孵育2 h， PBS漂洗3 次后拍照。成骨诱导7 d后，使用50 μl的0.2%Triton X-100对细胞进行低温裂解充分后，120 00 r/min高速离心15 min，使用ALP活性试剂盒对上清液中酶浓度进行检测，并测量在520 nm波长处的吸光度数值，计算平均值。

1.2.7 PCR检测细胞成骨相关基因 成骨诱导7 d后，使用Trizol裂解提取RNA，按照Prime ScriptTMRT Master Mix和TB GreenTMPremix Ex TaqTM操作说明进行逆转录，使用CFX96 实时荧光定量 PCR 仪进行RT-qPCR反应，检测 Runx2和BMP2的mRNA表达水平，GAPDH作为内参[7]。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 DNA水凝胶的制备与表征

凝胶涂层表面形貌见图 1A，DNA预凝胶具有高度多孔、孔径更大的互连结构； nSi加入后的DNA终凝胶孔径更小，平均孔径从216.2 μm显著降低到了26.8 μm。最终制备的复合材料截面形貌见图 1B)，镁基底阳极氧化后产生了分界清晰的MgO氧化层，其通过微裂隙与微孔的机械嵌合作用使最表面多孔的DNA水凝胶涂层结合更为紧密。

2.2 地塞米松加载和释放特性

DEX浓度标准曲线见图 2A，拟合的吸光度线性回归方程为y=0.4404x+3.458， R2=0.982。DNA预凝胶、终凝胶的体外DEX释放曲线见图 2B， 15 d内的DNA预凝胶中药物释放速率较快，药物释放的半衰期大约为2.5 d左右， 最终在12 d左右时药物释放完毕。DNA终凝胶由于它更为紧凑的结构和更小的孔径，药物释放时间延长，半衰期约为5 d左右，而大约需要15 d药物完全释放完毕。

2.3 修饰后镁表面细胞相容性

图1 DNA预凝胶与终凝胶表面形貌(A)与复合材料截面形貌(B) (×5 000)

Fig 1 Surface morphology of DNA pregel and final gel (A) and cross-sectional morphology of the composite materials(B) (×5 000)

图2 DEX标准曲线(A)与体外释放曲线(B) 图 3 MC3T3-E1的细胞增殖(CCK-8实验)

Fig 2 DEX standard curve(A)andinvitrorelease curve(B) Fig 3 Proliferation of MC3T3-E1(CCK-8 assay)

图4 MC3T3-E1 细胞的ALP染色 (ALP, ×100)

Fig 4 ALP staining of MC3T3-E1 cells (ALP staining, ×100)

第3 天CCK-8测量的MC3T3-E1细胞的活性如图 3显示，MgO组的细胞活力高于光滑的Mg组(P<0.01)，而DEX@DNA-MgO组的细胞活性较Mg组与MgO组都有了更为显著的升高(P<0.01)。

2.4 修饰后镁表面促进细胞成骨分化

7 d后ALP染色结果见图 4， Mg组只有散在ALP结晶， MgO组染色程度较深，但这2 组无明显差异， 而DEX@DNA-MgO组染色面积最大，且相互交联，该组表达了最高的ALP活性(P<0.01)。

图5显示， MC3T3-E1细胞在成骨诱导7 d后MgO组与Mg组的Runx2和BMP2表达水平并未见明显差异(P>0.05)，DEX@DNA-MgO组表达水平都有显著性的提高(P<0.01)。

3 讨 论

近年来，金属镁由于具备良好的机械强度、生物相容性及生物可降解性等优势，被学者们逐渐应用于GBR膜材料中。提升镁表面主动诱导骨形成的能力，在镁表面构筑生物活性涂层是研究的主流方向。

图 5 MC3T3-E1 细胞中Runx2、BMP2的mRNA表达水平

Fig 5 The mRNA expression of Runx2 and BMP2 of MC3T3-E1 cells

本研究对纯镁进行阳极氧化后退火处理，表面形成MgO涂层[8]，其微孔裂隙的存在可以进一步与加载的生物涂层机械嵌合[9]。DNA水凝胶是近些年来发展迅速的药物转运载体，具有序列可操纵性和优良的生物相容性，可用于智能的药物递送[10]。大多数DNA水凝胶的合成方法中，需要引入额外的官能团或其他聚合物[11]，这可能会带来生物安全问题。Basu等[12]通过简单的静电结合的相互作用使DNA形成物理交联网络，具有独特的优势。本实验采用的成胶过程通过加热冷却使DNA变性再杂交，游离的碱基对使相邻 DNA氢键互补形成预凝胶；纳米硅酸盐 nSi表面电荷的各向异性可以与磷酸基团静电结合成胶，在扫描电镜下观察，成胶后孔径更小，形成更为致密的交联网络，更有利于药物的封闭保存，因此在DEX药物的释放实验中，加入nSi的 DNA终凝胶表现出了很好的缓释作用，证明材料可以在骨缺损修复的进程中发挥持久的促成骨作用。

在体外细胞培养的CCK-8实验中，MgO组较Mg组对细胞有一定促增殖作用(P<0.01)，但单纯形貌改变的作用十分有限，DNA水凝胶的加载使细胞活性进一步明显增高(P<0.01)，证明了DNA水凝胶作为人体遗传物质，拥有更好的生物相容性。PCR检测成骨基因Runx2和BMP2表达、ALP染色和定量分析上，MgO组均未表现明显的促成骨分化能力(P>0.05)，而DNA水凝胶涂层组别都有着显著提升(P<0.01)。这说明DEX的加载大幅度提高了辅助诱导成骨的潜能，适合作为镁应用于GBR膜材料的辅助生物活性药物。

综上所述，在纯镁阳极氧化预处理的MgO 基底上，通过静电结合形成的DNA纳米复合水凝胶有着致密紧凑的结构与良好的DEX缓释效果，与MC3T3-E1细胞表现出良好的细胞相容性，可促进ALP的合成以及Runx2与BMP2基因的表达，为镁材料提供了更好的主动诱导成骨能力，为GBR膜材料的应用打下基础。