阿舒瑞韦联合达拉他韦治疗慢性丙型肝炎患者初步疗效及其病毒准种变化和耐药变异特征分析*

1 对象与方法

1.1 研究对象 2017年10月～2019年6月广州市第八人民医院门诊就诊的HCV 1b基因型感染的CHC患者40例，其中CHC和代偿期丙型肝炎肝硬化患者分别为27例和13例，α-干扰素经治或初治患者分别为15例和25例。纳入的患者符合中华医学会肝病学分会和感染病学分会发布的《丙型肝炎防治指南》的诊断标准[4]。所有纳入研究的患者均签署知情同意书，本研究方案经广州市第八人民医院医学伦理委员会审核通过。

(3)变异操作采用单点变异策略对机器选择链进行变异操作，随机选择一道工序，改变该工序的当前加工机器。采用互换变异策略对工序顺序链进行变异操作，如图7所示，随机选择不同位置两道工序，互换其基因值。

1.2 治疗方法给予所有患者ASV(百时施贵宝)100 mg口服，2次/d，DCV(百时施贵宝)60 mg口服，1次/d，治疗24 w。在治疗结束后继续随访12 w。

1.3 血清HCV耐药变异和准种分析使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，德国)病毒核酸提取试剂盒提取血RNA，使用HCV 1b基因型特异引物(5′-CTACCCCTACRGAAAGTAGGAGTAGGCA-3′，nt9324-nt9351，HCV H77，NC_004102)和PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大连)逆转录试剂盒行HCV RNA逆转录。根据HCV 1b基因型保守区设计引物(表1)，并在引物5’端随机加入6个已知序列碱基(用于数据分析阶段各混样基因片段的数据分离)，扩增血清包含NS3蛋白酶抑制剂和NS5A聚合酶抑制剂耐药位点的基因片段。另在治疗失败患者治疗前和复发时取血，扩增血清HCV的主要功能区域(Core、E1、E2、NS2、NS3、NS4、NS5A和NS5B)的部分基因(因二代测序读长的限制，设计每个片段扩增长度均小于500 bp，具体引物序列可向通讯作者索取)。使用巢式PCR和PrimeStar高保真酶(Takara，大连)扩增HCV各基因片段，对PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证，使用QIAquickGelExtractionKit(Qiagen，德国)胶回收试剂盒行PCR产物回收，使用Nanodrop2000核酸定量仪进行核酸定量。取每个样本DNA 20 ng进行混样，统一进行DNA文库的构建，在数据分析阶段进行数据分离。对上述混样的DNA基因产物，使用NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina(NEB，美国)行DNA文库的构建。对已构建的DNA文库送北京诺禾致源公司测序(Hiseq平台，PE250模式)。对二代测序错误率的估计：本研究在耐药变异的二代测序过程中，由于存在HCV RNA逆转录、PCR和测序等实验过程，均可引物碱基错误，故设立标准，评估整个体系中引入的错误率。根据我们课题组前期研究设立的质粒检测过程中引物的碱基错误率和文献报道[5-7]，定义1%以上的变异为阳性。ASV和DCV耐药相关变异的定义：参考文献[8-10]，ASV相关耐药变异(NS3)为：V36L、Q80K、S122N/R/T、D168A/H；DCV耐药相关变异(NS5A)为：L31M/F/V和Y93C/H/N。二代测序数据的处理：应用FASTX-Toolkits软件进行数据过滤，剔除Q30小于90%的序列。应用Flash v1.2.7软件进行序列的拼接。然后，应用Geneious R10.0.5软件进行数据进一步过滤与分析，剔除大于或小于预期片段长度的序列。应用Geneious R10.0.5软件，并以1%阳性截断点确定ASV和DCV耐药变异。应用香农熵指数(Sn)描述HCV准种多复杂度。使用遗传距离(d)、非同义突变率(dN)和同义突变率(dS)三个参数描述多样性[11,12]，并应用Tajima中性检验对治疗前和复发样本核酸分子进化特征分析。应用R语言Vegan包计算Sn，应用Mega7.0软件计算d、dN、dS和Tajima中性检验。最后，应用Geneious R10.0.5软件对复发样本核酸序列与治疗前核酸序列进行多序列比对，计算其同源性。

2.3 复发患者耐药变异和病毒准种变化特征分析 1例治疗失败的CHC患者为49岁男性，有输血和接受性服务史，基线血清HCV RNA为1.08×107IU/ml, ALT为74 U/L，B超未提示异常，肝脏硬度为5.9 Kpa，经ASV联合DCV治疗24 w，血清HCV RNA阴性，ALT为39 U/L，停药12周时血清HCV RNA为3.58×105IU/ml，ALT为76U/L。对基线和复发时血清核酸序列进行同源性检测，结果提示复发与基线血清各基因片段一致性序列为19.9%～45.2%之间，排除重新感染，考虑为复发(表2)。

2 结果

同源性计算方法为复发血清HCV核酸序列与基线血清核酸序列的多序列比对，一致性的序列定义为同源性序列2.4 基线与复发血清病毒耐药变异和准种变化特征分析我们对上述1例CHC患者基线和复发时病毒NS3蛋白酶抑制剂和NS5A抑制剂相关耐药变异进行了分析，结果提示在基线和复发时血清中，均未发现NS3蛋白酶抑制剂相关的耐药变异，但在基线时，存在L31V+Y93H的NS5A聚合酶抑制剂相关耐药变异，耐药变异频率分别为2.1%和56.2%，复发时也存在L31V+Y93H耐药变异，但变异频率均为100.0%。对HCV各基因片段准种多样性和复杂度的差异比较，结果提示在HCV基因组的主要区域基线准种复杂度均显著高于复发时血清。另外，我们对基线和复发时血清各HCV基因片段进行Tajima中性检验，结果提示基线各HCV基因片段序列的D值显著高于复发时(表3)。

《史记·太史公自序》明确说“太史公(司马谈)仕于建元、元封之间”，即司马谈为官的时间是在“建元”至“元封”之间。“建元”、“元封”均为汉武帝时年号，其间包括“元光”、“元朔”、“元狩”、“元鼎”等年号，时间跨度从公元前140年至前105年。“建元”共有六年，至于司马谈为官始于“建元”哪一年，司马迁虽然没有明载，但上限可确定为“建元元年”至“建元六年”，即前140—前135年的六年之间。

表1 引物序列

HCV NS3基因扩增的位置为：nt3518～3929；HCV NS5A扩增的位置为：nt 6349～6602，核酸位置基于HCV参考序列H77，NC-004102

厚靶通常是指靶板的厚度大大超过碰撞产生的坑深。小行星撞击地球形成陨石坑就是典型的超高速弹丸对厚靶(半无限厚靶)的侵彻现象，如图1所示。

2.2 ASV联合DCV治疗的临床疗效和安全性在本组40例患者中，38例(95.0%)在随访12周时获得SVR，2例(5.0%)未获得SVR；92.6%(25/27)CHC患者获得SVR，100.0%(13/13)代偿期丙型肝炎肝硬化均获得SVR；93.3%(14/15)α-干扰素经治和96.0%(24/25)初治的患者获得SVR。治疗失败的2例患者均存在NS5A抑制剂相关的耐药变异，其中1例为L31V+Y93H变异，另一例为Y93H耐药变异。在治疗过程中，有7例(17.5%)患者出现不良事件，其中2例(5.0%)血清ALT升高，2例(5.0%)出现血小板下降，1例(2.5%)血红蛋白下降，2例(5.0%)血尿酸升高。上述不良事件均在治疗过程中或治疗结束后恢复正常，未导致患者停药。

表2 1例复发患者基线与复发时血清HCV基因片段同源序列分析

2.1 一般资料在本组40例患者中，男性23例，女性17例；中位年龄为39(28，53)岁；病毒载量为6.3±0.8 lgIU/ml；15例(37.5%)为α-干扰素经治患者；10例(25.0%)患者基线谷丙转氨酶水平大于正常值上限；1例(2.5%)存在NS3蛋白酶抑制剂(ASV)相关的D168E基线耐药变异，1例(2.5%)存在NS5A聚合酶抑制剂(DCV)相关的L31M耐药变异，1例(2.5%)存在L31V/Y93H耐药变异，另2例(5.0%)存在Y93H耐药变异。

表3 基线与复发时血清HCV基因片段准种复杂度、多样性和Tajima中性检验差异比较

Sn、d、dN和dS的单位均为10-3变异/位点，基线血清HCV准种复杂度(Sn)、多样性(d、dN和dS)和Tajima中性检验的D值(配对t检验)均显著高于复发血清(P<0.05)

3 讨论

ASV联合DCV方案是在2017年在中国获批准上市，是国内首个上市的DAA药物，主要适用于HCV 1b基因型感染的CHC患者[4, 13]，该方案在上市前的临床试验和真实世界的研究均显示出良好的疗效和安全性[1,2,14]。

相比器官移植医学实践，我国器官移植立法起步较晚。2003年《深圳经济特区器官捐献移植条例》颁布，这是我国首部器官移植地方性法规。2006年卫生部制定《人体器官移植技术临床应用管理暂行规定》，2007年国务院通过《人体器官移植条例》，“任何组织或者个人不得以任何形式买卖人体器官，不得从事与买卖人体器官有关的活动”。关于器官移植可能承担的法律责任，除规定行政和民事责任外，还指出，违反本条例规定，有下列情形之一，构成犯罪的，依法追究刑事责任:未经公民本人同意摘取其活体器官的;公民生前表示不同意捐献其人体器官而摘取其尸体器官的;摘取未满18周岁公民的活体器官的。

本研究在小样本的短期观察发现该方案治疗CHC和丙型肝炎肝硬化患者疗效好，只有少数患者治疗失败，可能与存在DCV相关的L31V+Y93H耐药变异或Y93H耐药变异有关，提示存在基线NS5A抑制剂相关耐药变异者应避免选择ASV联合DCV治疗方案。

准种分析提示复发血清各HCV基因片段的准种复杂度和多样性显著低于基线血清，而Tajima中性检验提示复发血清D值显著小于0并小于基线血清，提示ASV联合DCV治疗方案对该例病情复发患者体内存在的L31V+Y93H耐药变异毒株敏感性差，有关研究还需扩大进行。