A20蛋白水平影响狼疮模型小鼠TLR2、4-p38MAPK/NF-kB信号通路的初步研究★

张 丽，李晓岚

（昆明医科大学第二附属医院，云南 昆明 650101）

系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一种可累及多种器官组织并以淋巴细胞异常活化、大量自身抗体产生和免疫复合物形成为特征的自身免疫性疾病，其病因及发病机制尚未阐明，微生物如细菌或病毒感染可通过模拟自身抗原机制诱发本病或致病情复燃。随着SLE治疗水平的不断提高，患者因SLE疾病本身所致的死亡降低，而因治疗药物所导致的并发症如感染等却导致死亡增加。Toll样 受 体2（Toll like receptor 2,TLR2） 和Toll样受体 4（Toll like receptor 4,TLR4）是先天固有免疫的重要因子，在抗菌抗感染免疫中起着主要作用，可激活下游信号分子丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-actived protein kinase p38,p38MAPK）和核因子κB（Nuclear factor-kappa B,NF-κB）,从而诱导大量细胞因子及炎症因子产生，加重SLE的炎症反 应[1、2]。A20（Tumor necrosis factor α-l induced protein 3,TNFAIP3）基因作为SLE的易感基因，其异常表达与SLE的发病密切相关。有研究发现A20基因缺陷的小鼠对LPS及TNF的敏感性异常增强，此外还发现SLE患者异常低表达A20蛋白可致p38MAPK及NF-κB持续过度活化[3-5]。本研究利用瑞香素（Daphnetin）可刺激提高A20蛋白水平而发挥其抗炎作用的特性[5]，通过注射瑞香素提高SLE模型小鼠PBMC中A20蛋白的水平，观察能否抑制TLR2、4-p38MAPK/NF-κB信号通路以缓解SLE小鼠的炎症反应，为临床研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 （4～5）周龄MRL/lpr和BALB/c雌性小鼠，SPF级，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK（沪）2017-0005。

1.1.2 实验药品与主要试剂 瑞香素，小鼠外周血单个核细胞分离液，BCA蛋白定量试剂盒，考马斯亮蓝G-250（大连美仑生物公司）；小鼠尿素氮试剂盒（Solarbio公司）；兔抗小鼠GAPDH多克隆抗体，兔抗小鼠β-actin多克隆抗体，HRP标记山羊抗兔IgG，小鼠IL-6 ELISA 试剂盒，小鼠TNF-α ELISA 试剂盒（Proteintech公司）；小鼠anti-dsDNA IgG ELISA试剂盒（Alpha Diagnostic公司）；兔抗小鼠NFκB-p65多克隆抗体，兔抗小鼠pNFκB-p65多克隆抗体，兔抗小鼠p38MAPK多克隆抗体，兔抗小鼠pp38MAPK多克隆抗体（CST公司）；兔抗小鼠A20多克隆抗体，兔抗小鼠TLR4多克隆抗体，兔抗小鼠TLR2多克隆抗体（万类生物公司）。

1.1.3 主要设备 分光光度计，酶标仪（Thermo公司）；Western blot电泳仪（北京六一公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物实验 36只MRL/lpr和18只BALB/c雌性小鼠均由中国科学院昆明动物研究所统一饲养（清洁级）。随机将两类小鼠分为BALB/c小鼠阴性对照组（Sham，n=18）、MRL/lpr小鼠未处理组（SLE，n=18）、MRL/lpr小鼠瑞香素处理组（Daphnetin，n=18）。适应性饲养2周后，治疗组小鼠1次/d经腹腔注射100μl瑞香素溶液（瑞香素，4mg/kg），连续6周；同时未治疗组及阴性对照组1次/d经腹腔注射100μl生理盐水，连续6周。在此期间注重观察各组小鼠毛发及体重的变化以及生存率。给药结束后，取各组小鼠24h尿液并用分别盛有分离胶、促凝剂及肝素钠的离心管经内眦静脉收集全血，随后将含有促凝剂的全血经3 000 r·min-1离心10min，分离得到血清；向含有肝素钠的全血中加入等体积的PBS进行稀释，并用小鼠外周血单个核细胞分离液分离出外周血单个核细胞，经RIPA裂解液裂解后离心取上清为蛋白样品，再用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。随即将处理得到的样本-80℃保存备用。

1.2.2 指标检测 ① 小鼠毛发及体重的变化和生存率：直至给药结束期间，每周测量各组小鼠平均体重以及记录各组小鼠死亡情况，并在此期间观察各组小鼠毛发的变化，拍照记录。② 肾脏功能评估：利用考马斯亮蓝法检测尿蛋白以及用小鼠血尿素氮检测试剂盒检测血尿素氮，按试剂说明书操作。 ③ ELISA法 检 测anti-dsDNA IgG、TNF-α及IL-6：取保存备用的血清，步骤按试剂盒说明书操作。④ Western Blot法检测A20、NFκB-p65、pNFκB-p65、p38MAPK、pp38MAPK以及TLR2、TLR4蛋白表达情况：将待测蛋白进行等量蛋白上样，Marker上样5μl，进行SDS-PAGE，湿转条件以100mA/200V/90min将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭3h后一抗封闭过夜，二抗孵育2h后洗膜滴显影剂采用化学发光成像系统采集图像。

1.2.3 统计学分析 采用SPSS 19.0版统计软件包对数据进行分析，结果表示为均数±标准差（±s），采用单因素方差分析（One-way ANOVA）统计组间差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果和分析

2.1 小鼠一般情况 实验开始前，各组小鼠毛发顺滑有光泽，进食正常，状态良好。实验结束后，SLE组小鼠消瘦，毛发凌乱、脱落、干枯无光泽；Daphnetin组状态较好，同Sham组小鼠毛发依然顺滑、有光泽。SLE组小鼠6只死亡，Daphnetin组小鼠2只死亡，Sham组小鼠无一死亡（图1）。

2.2 小鼠体质量变化情况 在取样前，SLE组小鼠第8周龄时平均体质量增加幅度较Daphnetin组变缓，第9周龄时SLE组小鼠平均体质量开始持续下降，变得消瘦；相反，Daphnetin组小鼠平均体质量持续增加，直至取样；Sham组小鼠平均体质量增至7周龄时不再变化（图2）。

图1 小鼠一般状态

图2 三组小鼠体质量变化情况

2.3 小鼠生存率分析 三组小鼠的存活率分别为Sham组：100%；SLE组：66.7%；Daphnetin组：88.9%。Daphnetin组和Sham组小鼠存活率都高于SLE 组（图 3）。

图3 三组小鼠生存率示意图

2.4 小鼠A20蛋白的表达 Daphnetin组小鼠PBMC中A20蛋白表达显著高于SLE组小鼠；Sham组小鼠和SLE组小鼠PBMC中A20蛋白表达没有显著差别（图4）。

图4 A20蛋白在小鼠中的高表达

图5 A20高表达降低了小鼠尿蛋白和血尿素氮水平

2.5 小鼠尿蛋白和血尿素氮水平 SLE组小鼠尿蛋白及血尿素氮水平显著高于Sham组小鼠，而Daphnetin组小鼠尿蛋白及血尿素氮水平低于SLE组小鼠（图5）。2.6 小鼠血清anti-dsDNA IgG水平 SLE组小鼠血清anti-dsDNA IgG水平显著高于Sham组小鼠，而Daphnetin组小鼠血清anti-dsDNA IgG水平低于SLE组小鼠（图6）。

图6 A20高表达降低了小鼠血清anti-dsDNA IgG水平

2.7 小鼠血清IL-6、TNF-α水平 SLE组小鼠血清IL-6、TNF-α水平显著高于Sham组小鼠，而Daphnetin组小鼠血清IL-6、TNF-α水平低于SLE组小鼠（图7）。

图7 A20高表达降低了小鼠血清IL-6、TNF-α水平

2.8 小鼠TLR2、TLR4蛋白的表达及pNFκB-p65、pp38MAPK活性 SLE组小鼠PBMC的TLR2、TLR4、pNFκB-p65及pp38MAPK的表达显著高于Sham组小鼠，而Daphnetin组小鼠PBMC的TLR2、TLR4、pNFκB-p65及pp38MAPK的表达低于SLE组小鼠（图 8）。

3 讨论

图8 A20抑制了小鼠TLR2、TLR4、pNFκB-p65和pp38MAPK蛋白的表达

近年来，通过研究抑制信号传导通路减少细胞炎症因子的释放，从而控制 SLE的进展，已经成为治疗SLE的新思路。多项研究表明，SLE患者出现 p38MAPK 及 NF-κB 过度活化的现象[6、7]，而这两条信号通路受多分子调控，其中就包括Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）。作为天然免疫与获得性免疫的桥梁，有研究报道SLE患者体内存在TLRs表达水平的异常，不同的TLRs发挥着协同或不同的作用，TLR2和TLR4作为细菌感染的主要受体，可通过识别病原体病原相关分子模式与相应配体结合而启动细胞内信号传导，通过激活p38MAPK及NF-κB最终引起大量促炎因子IL-6、IL-1β及TNF-α等的分泌，导致SLE患者肾脏、肝脏等多脏器的损伤[8]。有报道称SLE患者稳定组、活动组和合并感染组外周血PBMC中TLR2和TLR4表达明显高于正常对照组，说明TLR2和TLR4在SLE的发病中发挥着重要作用。本研究通过MRL/lpr狼疮小鼠模型，将MRL/lpr未治疗组与阴性对照组比较，其结果表明，MRL/lpr未处理组小鼠较阴性对照组小鼠尿蛋白及血清中血尿素氮明显增多，血清anti-dsDNA IgG产生增加和血清IL-6、TNF-α 分 泌 增 多 以 及PBMC中TLR2、TLR4、pNFκB-p65及pp38MAPK表达水平增加，提示TLR2、4-p38MAPK/NF-κB该信号通路积极参与了MRL/lpr狼疮小鼠的发病机制。

A20作为一种具有强大抗炎功能的蛋白，利用自身N端的去泛素化功能和C端的泛素化活性，可以负调控作用于p38MAPK/NF-κB两条信号通路上的多种信号分子，减少细胞炎症因子的产生，这主要通过TNF途径和TLR途径来完成[9、10]。其中TLR主要由髓样分化因子（MyD88）依赖及非依赖途径激活，A20蛋白通过去除TRAF6泛素化从而抑制TLR途径。有研究证实，当IL-1β和LPS刺激后，可招募MyD88和TRAF6聚积至细胞内的TLR/IL-1R区。A20通过去除TRAF6的K63多聚泛素链以及干扰TRAF6与Ubc13/H5的结合，使Ubc5和Ubc13被蛋白酶体降解来抑制TRAF6的泛素化作用和活化，进而抑制TAK1与下游信号分子的相互作用，从而达到抑制p38MAPK/NF-κB活化的目的[11]。在本研究中，与MRL/lpr未处理组小鼠比较，Daphnetin处理组小鼠PBMC中A20蛋白表达水平显著提高。结果 显示高表达的A20能改善狼疮模型小鼠营养和生长状况；高表达的A20能降低狼疮模型小鼠促炎细胞因子IL-6、TNF-α和自身抗体anti-dsDNA IgG水平；高表达的A20能抑制TLR2、TLR4的表达及p38MAPK、NF-κB的活化；高表达的A20能减轻狼疮相关的肾脏损伤使得小鼠尿蛋白及血清中血尿素氮减少。因此，A20的高表达可抑制TLR2、4-p38MAPK/NF-κB信号通路，从而明显改善对MRL/lpr狼疮模型小鼠的炎症反应。

综上所述，提高MRL/lpr狼疮模型小鼠体内的A20蛋白表达能显著抑制TLR2、4-p38MAPK/NF-κB信号通路，对MRL/lpr狼疮模型小鼠的相关症状起着缓解和治疗作用。由此可见，诱导提高抗炎分子A20的表达将有望成为治疗SLE疾病的新策略。