中缅树鼩尿液成分及性别和亲缘关系的影响

侯东敏 贾 婷 章 迪 谌立新 王政昆 朱万龙，3，4*

(1.云南省高校西南山地生态系统动植物生态适应进化及保护重点实验室，云南师范大学生命科学学院，昆明，650500；2.云南经济管理学院，昆明，650106；3.生物能源持续开发利用教育部工程研究中心，昆明，650500；4.云南省生物质能与环境生物技术重点实验室，昆明，650500)

化学通讯交流在动物的生殖和社会行为中起着重要的作用，包括性吸引[1]、性冲动[2]、领域标记[3]以及个体识别[4]等。随着现代科学技术的迅猛发展，借助气相色谱质谱联用技术对动物化学通讯中尿液、血液或腺体分泌物化学成分的分析已成为研究热潮[5-6]。

尿液是动物化学通讯中传递信息的重要途径之一。动物尿液中的许多低分子量的化学成分可以通过嗅觉器官被感知，从而引起特定的行为反应[7-8]。啮齿类动物尿液中含有较多的信息素，如3-乙基-2，7-二甲基辛烷(3-ethyl-2，7-dimethyl octane)是一种雄性小家鼠(Musmusculus)中特有的化学成分，具有释放信息素的作用，其产生受雄性激素控制[9]；戊醛到癸醛的脂肪族醛作为小鼠气味成分而被其主要嗅觉器官感知，因此这些成分可能对小鼠同种群个体识别具有重要作用[10]；小鼠尿液中的6-羟基-6-甲基-3-庚酮(6-hydroxy-6-methyl-3-heptanone)是一种独特成分，它能够加速雌性小鼠的青春期[11]；小鼠尿液中还含有诸如年龄[12]、健康[13]、繁殖[14]及亲属和个体识别[15]等大量信息。哺乳动物的尿液成分较为复杂，如大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)可以通过尿液进行亲缘识别，避免近亲交配[16]；狮(Pantheraleo)雄性尿液中2-丁酮(2-butanone)的相对含量显著高于雌性，而雌性丙酮(acetone)的相对含量显著于雄性[17]；短尾猫(Lynxrufus)的尿液能够减少土拨鼠的气味标记活动，而且能够减少美洲兔(Lepusamericanus)和黑尾鹿(Odocoileushemionus)的摄食行为[18]。动物尿液中包含许多重要信息，对于其他物种或者同种群个体都是化学感知的丰富来源。

动物常通过将尿液、粪便或腺体分泌物遗留于环境中来进行个体信息的交互响应，但这种社会活动往往受到遗传和空间距离的影响[19]。通过对小鼠尿液与遗传相关性的研究表明，小鼠尿液挥发性成分的相对丰度与遗传相关性程度有关，这一关系可能在该物种的化学信号传递和遗传特性中起到关键作用[20]。同样亲缘关系和空间距离对长爪沙鼠(Merionesunguiculatus)的尿标记行为具有一定影响，这与长爪沙鼠的繁殖或贮食行为相适应[21]。因此尿液挥发性成分可以提供有关遗传相关性的嗅觉信息，并作为表型匹配的遗传标识符。

中缅树鼩(Tupaiabelangeri)属攀鼩目(Scandentia)，树鼩科(Tupaiidae)，分布于南亚、东南亚以及中国南部和西南部地区，为东洋界特有的昼行性小型哺乳动物[22]。因其在生物学特征及生理生化等方面与人类较为相近，已被用作非人灵长类动物的替代模型广泛地应用于生物医学研究[23]。本研究通过气相色谱质谱联用技术对野外亲属中缅树鼩的尿液化学成分进行测定，旨在探索尿液对野外中缅树鼩的作用，为揭示中缅树鼩的通讯机制提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

动物样本采集于昆明市海口林场，共捕捉成体42只，捕捉后采集动物样本粪便，低温保存，温度为(-20±1)℃。采集动物样本粪便，提取粪便DNA，选择高度多态性的微卫星引物扩增并进行测序，所得结果采用Cervus 3.0软件进行亲缘关系模拟鉴定，检测得到具亲缘关系共计16只成年个体(9♀∶7♂)，分为A、B、C、D、E共5组，5组之间的动物个体无亲缘关系，组内个体具有亲缘关系。所用实验动物均在昆明市海口林场饲养房内饲养。

1.2 尿液采集

将实验动物禁食12 h后放入尿液采集笼中，采集笼下端放置漏斗及12 mL样品瓶(宁波哈迈，HM-1266A)；漏斗内部放置薄脱脂棉以防粪便污染；尿液收集时间为10 min，收集完成后迅速使用封口膜密封瓶口，并置于-20℃密封避光保存。

1.3 尿液样品前处理

使用固相微萃取法进行尿液样品吸附处理[24]：(1)萃取头(50/30 μm DVB/Caron PDMS，Supelco公司，美国)老化：将萃取头置入气相色谱进样口，进样口温度250℃，老化30 min。(2)取动物尿液样品5 mL置于15 mL顶空瓶中，顶空瓶内放置磁子，50 ℃水浴30 min，然后将固相微萃取装置插入瓶内，吸附萃取40 min，然后将萃取头置于气相色谱仪的进样口进样。

1.4 气相色谱质谱联用技术

尿液化学成分测定采用气相色谱质谱联用仪(GCMS-QP2010，岛津公司，日本)；色谱柱：INNWAX(30 m×0.32 mm×0.50 μm)；色谱条件：进样口温度为250 ℃；载气：He，纯度为99.999%；柱流速：2.54 mL/min；程序升温：初始40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。质谱条件：离子源温度220 ℃；传输线温度220 ℃；全扫描方式；扫描范围：40—500 amu。所得质谱图利用计算机谱库NIST(National Institute of Standards and Technology)进行相似度检索，根据质谱库中物质的匹配度，再结合物质保留时间和文献资料[25]来鉴定尿液样品中的化学成分。

1.5 统计分析

采用Excel 2010和Cervus 3.0进行亲缘关系的鉴定，采用Excel 2010进行尿液化学成分的统计分析，采用Origin 8.5软件制作色谱图。

2 结果

2.1 野外亲属中缅树鼩尿液的化学成分

通过对野外亲属中缅树鼩尿液检测共得到化学成分450种，其中有效化学成分(≧3个样本中检测到某化学成分)145种(表1)，包括醇类46种、酮类30种、烃类21种、醛类15种、酯类8种、酚类7种、吡嗪5种、酸类3种、醚类3种、吡啶1种、腈类1种、芳香烃1种、其他4种。

表1 野外亲属中缅树鼩尿液化学成分Tab.1 Chemical composition of urine in wild Tupaia belangeri

2.2 野外亲属中缅树鼩不同性别个体尿液的特有化学成分

野外亲属中缅树鼩雌雄个体尿液中包含特有的化学成分(表2)。雄性个体中的特有化学成分有5种，分别为苯酚(phenol)、2，2，6-三甲基环庚烷(2，2，6-trimethyl-cyclohexanone)、2-乙基-5-甲基吡嗪(2-ethyl-5-methyl-pyrazine)、3-乙基-2，5-二甲基吡嗪(3-ethyl-2，5-dimethyl-pyrazine)、1，6-二甲基环辛基-1，5-二烯(1，6-dimethyl-1，5-cyclooctadiene)。其中吡嗪2种、烃类、酮类、酚类各1种。尿液化学成分的代表性(C1)色谱图见图1。

表2 野外中缅树鼩雌雄尿液特有化学成分Tab.2 Chemical constituents of male and female urine in wild Tupaia belangeri

图1 野外亲属中缅树鼩尿液代表性色谱图(C1)Fig.1 Representative GC profile of urine in wild Tupaia belangeri(C1)

雌性个体中的特有化学成分有11种，分别为2-甲基-1-辛醇(2-methyl-1-octanol)、反式-3-壬烯-1-醇(E-3-nonen-1-ol)、乙酸橙花叔醇酯(nerolidyl acetate)、戊醇(1-pentanol)、二氢月桂烯醇(dihydromyrcenol)、3，7-二甲基-1-辛醇(3，7-dimethyl-1-octanol)等。其中醇类7种、酯类2种、烃类、酮类各1种。

2.3 野外亲属中缅树鼩组内单独缺失和特有化学成分

通过对不同组亲属中缅树鼩尿液的比较发现，每组均含有单独缺失的化学成分(表3)。其中A组6种、B组4种、C组2种、D组8种、E组10种。而仅有C组亲属中缅树鼩的尿液中含有特有的化学成分，即3-庚醇(3-heptanol)，且在C组每个样本中均检测到此成分存在。其余各种物质均存在于两组以上。

表3 野外中缅树鼩尿液组内单独缺失和特有化学成分Tab.3 Individual deletions and unique chemical constituents in wild Tupaia belangeri

3 讨论

动物识别个体的能力对于维持其稳定的社会群体、亲子动态、避免近亲繁殖以及调节竞争关系至关重要[26]。本研究检测得到野外中缅树鼩尿液有效化学成分145种，远大于实验室驯化和繁殖中缅树鼩的51种[27]。这可能是由于野外食物和栖息地相较于实验室更为丰富复杂。本研究中野外亲属中缅树鼩尿液的化学成分种类与实验室繁殖亲属中缅树鼩大致相似，但是野外亲属中缅树鼩尿液的化学成分的数量与实验室繁殖亲属中缅树鼩相比较多[24]。这可能是因为野外与实验室繁殖中缅树鼩属于同一物种，因此尿液化学成分种类相似，但由于两者生存环境和食物资源的不同导致尿液化学成分数量不同。

尿液化学通讯动物个体识别或亲缘识别的途径之一，动物尿液中含有大量可用于化学通讯的微量化学成分[28]。研究表明，狼(Canislupus)尿液中吡嗪类化学成分能够通过刺激小鼠的副嗅球来诱发其躲避和恐惧僵化行为[29]，其中3-乙基-2，5-二甲基吡嗪(3-ethyl-2，5-dimethyl-pyrazine)、5-乙基-2，3-二甲基吡嗪(5-ethyl-2，3-dimethyl-pyrazine)和2，3-二乙基吡嗪(2，3-diethyl-pyrazine)是诱发小鼠产生恐惧最活跃的化学成分[30]。本研究中，同样检测到3-乙基-2，5-二甲基吡嗪(3-ethyl-2，5-dimethyl-pyrazine)和2-乙基-5-甲基吡嗪(2-ethyl-5-methyl-pyrazine)两种吡嗪类成分，且为雄性个体特有物质，由此推测野外中缅树鼩能够通过尿液传递信息。

在动物尿液中，有许多化学成分是编码信息的关键组成部分，如丁酸(butyric acid)、2-甲基丁酸(2-methyl butyric acid)和4-庚酮(4-heptanone)等可能影响小鼠的社会等级、个体年龄和繁殖经历[31]。本研究中也检测出类似成分，且不同亲属关系的中缅树鼩检测出的化学成分存在差异，其中3-庚醇(3-heptanol)仅在一组野外亲属中缅树鼩中出现且组内样本均检测存在。实验所用野外中缅树鼩均捕获自同一地区，食物资源及生存环境极为相似，由此推测导致野外不同亲属关系中缅树鼩尿液成分不同的原因可能为亲属关系的远近或者社会等级的分化。而其他组均含有单独缺失的不同种类的化学成分，由此推测野外中缅树鼩的亲属信息由多种组分共同编码，但不同化学成分是否通过其含量变化影响亲属识别还须进一步探索。

综上所述，食物和栖息地的复杂性影响野外中缅树鼩尿液化学成分种类；雌雄个体中尿液成分不同，吡嗪类化学成分可能影响其种内争斗或种间竞争；亲属关系的远近或者社会等级的分化导致野外不同亲属关系中缅树鼩尿液成分的不同。野外中缅树鼩可能通过尿液进行个体识别和亲缘识别，这为进一步揭示中缅树鼩的通讯机制提供了科学理论依据。

续表1

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