赤链华游蛇形态和血液学参数及各型白细胞百分比的增龄变化

刘溯源 海思娆 王 鑫 徐文宁 伍 亮 汪 寅 姚 利 张志强

(安徽农业大学动物科技学院，合肥，230036)

选择适用于脊椎动物研究使用的免疫学参数，是新兴学科-免疫生态学(immunological ecology)需要解决的主要问题之一[1-3]。血液成分和血细胞的数量动态与脊椎动物免疫功能的变化有关[4]，尽管这些指标易受外界环境条件及自身身体状态的影响，但若能在严格受控的环境条件下进行实验，仍不失为比较研究的好方法之一[3-5]。研究表明，变态前后两栖动物血液中各型白细胞的百分比具有可塑性(plasticity)[5-6]，但对爬行动物免疫功能的发育可塑性，仍所知甚少[7-9]，多集中于成体蛇物种间各型白细胞的百分比和红细胞大小的比较研究[10-15]。蛇类中，除对陆生的30日龄内的王锦蛇(Elaphecarinata)[7]和50日龄内的滑鼠蛇(Ptyasmucosus)[8]各型白细胞的百分比，以及食物蛋白浓度对王锦蛇生长和血液学参数的影响做过研究外[9]，尚无关于蛇类免疫功能发育生物学方面的研究。

蛇类普遍有耐受极端环境条件的能力，是研究表型可塑性(phenotypic plasticity)理论的理想动物类群之一[16-17]。赤链华游蛇(Sinonatrixannularis)又名水赤链等，是华东及华南地区稻田、池塘、溪流等水域及其附近常见的一种中型游蛇，白天活动，吃鱼，也食蛙类及蝌蚪，卵胎生，怀仔蛇量8—28个，9月前后产仔蛇10条左右(3—14条)[18]。目前，大多数研究与胚胎发育[19]及成蛇的形态、生理等有关[20-22]，对出生后各器官大小和血液学参数的可塑性变化仍未见研究。出壳或产出后1—2个月通常是幼蛇成活的关键阶段，涉及出生、第一次蜕皮和开口等生活史过程[23]。本研究以室内产出的赤链华游蛇幼蛇为研究对象，对出生后3、7—10(第一次蜕皮)、20、30、40和50 d的幼蛇，分别测定了重长比、脾脏湿重指数、血液学参数和各型白细胞百分比的变化，旨在建立出生后特定生活史阶段与免疫功能建立的对应关系，丰富爬行动物免疫生态学的基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物来源与分组

试验用9条怀孕母蛇，于2018年9月购自安徽省池州市贵池区某蛇场，暂养于安徽农业大学动物科技学院动物生理生态学实验室，每个饲养箱(48.0 cm×30.0 cm×30.0 cm)饲养一条母蛇。9条母蛇共产9窝幼蛇，每窝8—14条，同一窝幼蛇饲养于爬宠用亚克力盒子(26.0 cm×17.5 cm×12.5 cm)，盒内置小木板，供幼蛇上陆栖息，水为曝气24 h以上的自来水。空调和加热棒分别控制室温和水温，使水温稳定在(29±1)℃。首次蜕皮后，喂食解冻后剪成小条状的小块鲫鱼肉，方便幼蛇进食，每2 d喂食一次。在幼蛇出生后3 d、首次蜕皮，以及开口后10、20、30和40 d，每窝随机取幼蛇1条，每个时间点取幼蛇8条，6个时间点共取样48条幼蛇，测量体重、体长和尾长后，断头处死，采集血液。

1.2 血液学参数的测定

血红蛋白含量采用改良的沙利氏法通过血红蛋白计(泰州市姜堰区汇虹实验仪器厂)测定[24]，即在比色管中先加入400 μL 1.1 mol/L HCl，再加入5 μL血液混匀至呈黄褐色，静置10 min后，用蒸馏水稀释，与标准色比色，用标准色的绝对值表示血红蛋白含量。

红细胞总数和白细胞总数测定简述如下[24]：取995 μL的0.9%氯化钠溶液作为红细胞稀释液，加入5 μL血液混匀；另取10 μL血液，加入190 μL的白细胞稀释液(冰醋酸1.5 mL，1%龙胆紫1 mL，蒸馏水定容至100 mL)，混匀。各取混匀后的红细胞和白细胞混合液各10 μL，充入血球计数板计数池与盖玻片的缝隙中，静置2—3 min后，待细胞下沉后，镜检观察并计数。红细胞数总数=N×50×106×200=N× 1010，式中N为四角及中间各16个中方格内的红细胞总数；白细胞数总数=四角各16个中方格内的白细胞总数×10×20×106/4。

1.3 血涂片制作和各型白细胞百分比的测定

移取约20 μL血液，制作2张血涂片。通过南京建成生物工程有限公司生产的快速瑞姬氏染液(产品编号：D010)处理血涂片，参照孙嘉珞等[7]和张志强等[8]描述的操作步骤，用智能血球分类计数器(姜堰市天力医疗器械有限公司，产品编号：TL-2000A)计数每张血涂片中嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的总数至100个为止，计算各型白细胞占白细胞总数的百分比，以2张血涂片各型白细胞的平均值表示每条幼蛇各型白细胞占白细胞总数的百分比。

1.4 数据处理与统计分析

用SPSS 19.0 for windows进行数据处理和统计分析。用单因素方差分析(one-way ANOVA)及多重比较(multiple comparisons)统计不同发育阶段赤链华游蛇重长比、脾脏湿重指数、血红蛋白含量、经常用对数转换后的红细胞总数和白细胞总数、各型白细胞的百分比及嗜中性粒细胞与淋巴细胞的比值(ratio of neutrophils to lymphocyte，N/L的比值)的组间差异。文中数据均以平均值±标准误(mean±SEM)表示，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 50日龄内赤链华游蛇重长比和脾脏湿重指数的变化

由表1所示，赤链华游蛇的重长比3和7—10日龄组显著高于30、40和50日龄组(P<0.05)，脾脏湿重指数7—10日龄组显著高于40和50日龄组(P<0.05)。

2.2 50日龄内赤链华游蛇血液学参数的变化

由表1所示，血红蛋白含量30日龄组与40和50日龄组均无显著差异，3日龄组最低，30日龄组显著高于3、7—10和20日龄组(P<0.05)。经常用对数转换后，红细胞总数不随日龄而变化(P>0.05)，白细胞总数20日龄组与30日龄组接近，但显著高于3、7—10、40和50日龄组(P<0.05)。

2.3 50日龄内赤链华游蛇各型白细胞的百分比的变化

由表1所示，淋巴细胞的百分比和嗜碱性粒细胞的百分比占比居于前两位。淋巴细胞的百分比7—10日龄组显著高于30日龄组，30日龄组又显著高于50日龄组(P<0.05)。嗜碱性粒细胞的百分比40日龄组显著高于7—10和20日龄组(P<0.05)。嗜中性粒细胞的百分比7—10和20日龄组均显著高于50日龄组(P<0.05)。嗜酸性粒细胞的百分比50日龄组显著高于3、7—10、20和30日龄组(P<0.05)。单核细胞的百分比50日龄组显著高于其他日龄组(P<0.05)。N/L的比值无明显的日龄差异(P>0.05)。

表1 赤链华游蛇重长比、脾脏湿重指数、血液学参数和各型白细胞的百分比的变化(平均值±标准误)Tab.1 Changes of the ratio of body mass to total body length，spleen wet mass index，hematological parameters and different subtypes of leukocyte in Sinonatrix annularis(mean±SEM)

3 讨论

3.1 不同发育阶段赤链华游蛇重长比和脾脏湿重指数的变化

重长比是指示蛇体健康状态的重要指标[7-9，25]，赤链华游蛇开口前主要依赖出生后体内积累的脂肪来保证存活，因此从出生至开口前重长比急速下降，但在开口摄食后趋于稳定的低水平。理论上，主动摄食后，随着营养水平的提高，重长比应快速上升[25]。例如，滑鼠蛇生后3、7—10、20、30、40和50日龄，重长比3—20日龄增长缓慢，之后陡增，50日龄最高[8]。赤链华游蛇虽然终生生长，但50日龄内生长较缓慢，重长比表现出下降趋势。这可能与两方面的原因有关：一是本研究投喂的是冰冻后又解冻的鲫鱼肉，幼蛇虽有摄食，但并非是其最喜好的食物；二是50 d的处理时间偏短，赤链华游蛇对非鲜活食物需要较长时间的适应过程。野外条件下，赤链华游蛇主要靠摄食小鱼或蝌蚪来补充能量[18]。

变温脊椎动物中，脾脏湿重指数不受季节[26-27]等环境因素的影响，但在鸟类中可用于指示其机能状态[28]。赤链华游蛇首次蜕皮后的脾脏湿重指数显著高于40和50日龄组，这与脊椎动物的淋巴器官大小随年龄增加而趋于萎缩的趋势一致。

3.2 赤链华游蛇血液学参数和各型白细胞的发育可塑性

赤链华游蛇血红蛋白含量30日龄时最高，与40和50日龄组接近，但显著高于3、7—10和20日龄组，而红细胞总数未见日龄差异。血红蛋白是红细胞的主要成分，由珠蛋白和血色素组成，能与氧结合，运输氧和二氧化碳，临床上可作为反映身体贫血程度的一个指标[5]。赤链华游蛇首次蜕皮后开始主动摄食，活动加强，随日龄而增加的血红蛋白含量有助于满足日益增加的能量代谢需求、抵御不良环境条件的侵袭。

赤链华游蛇的白细胞总数在开口摄食后10和20 d时显著增加，各型白细胞的百分比随发育进程动态波动。其中，嗜中性粒细胞和淋巴细胞的百分比均在首次蜕皮和/或开口摄食后增加，而嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞的百分比却降低，N/L的比值未见明显的日龄差异。研究表明，成蛇血液中各型白细胞的百分比不但具有物种特异性，而且易于受外界环境条件和蛇类自身生理状态的影响[10-15]。在实验室内严格受控的环境条件下，30日龄内的王锦蛇在出壳后血液中就已存在不同类型的白细胞，20日龄内单核细胞的百分比下降，嗜酸性粒细胞的百分比明显增加，这可能与开口后的食物刺激有关，也可能与王锦蛇幼蛇喜好彼此撕咬的生物学习性有关[7]；50日龄内的滑鼠蛇淋巴细胞和嗜中性粒细胞的百分比占比居前两位，但两者的百分比及N/L的比值均无组间差异；嗜碱性粒细胞的百分比7—10日龄组与3日龄组接近，但7—10日龄组高于其他日龄组[8]。王锦蛇和滑鼠蛇都是适于人工养殖的陆生无毒蛇，两种蛇也都在出壳后就发育出完善的各型白细胞，这与赤链华游蛇相同，提示蛇类在出生前免疫系统可能就已建立[7-8]。此外，与滑鼠蛇相同，赤链华游蛇N/L的比值也不随发育阶段而大幅度波动，说明该比值并不能准确反映蛇体的应激状态[8]。然而，出生后早期阶段赤链华游蛇、王锦蛇和滑鼠蛇血液中各型白细胞的百分比的变化模式迥异，提示由于生活环境、食性等方面的差异，出生、首次蜕皮和开口时间早晚对多种蛇类的生活史过程可能会有完全不同的影响[7-8]。

4 结论

赤链华游蛇重长比和脾脏湿重指数均随发育进程的推进而下降，白细胞总数、血红蛋白含量、嗜中性粒细胞和淋巴细胞均在首次蜕皮和/或开口摄食后数量较多，其他类型的白细胞数量较少，但红细胞总数和N/L的比值无组间差异，说明赤链华游蛇在出生后的发育早期就已建立起较为完善的免疫功能，在耗能较多的蜕皮、开口摄食等生活史阶段，能通过调整白细胞总数、各型白细胞的比例来适应特定阶段的营养和能量需求，促进幼蛇快速生长。