13种呼吸道病原体多重检测试剂的性能验证*

吕园，邬兰，张秀梅，徐秋爽，张健，李萍，王海鹏，俞杨(南京市第一医院 南京医科大学附属南京医院核医学科实验诊断部，南京 210006)

性能验证指使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能。中国合格评定国家认可委员会(CNAS)2019年2月15日发布并实施CNAS-GL039：2019《分子诊断检验程序性能验证指南》[1]。本研究参照其要求，以13种呼吸道病原体多重检测试剂盒(PCR 毛细电泳片段分析法)说明书中的性能指标作为验证结果的判断标准，进行方法符合率、检出限、交叉反应和抗干扰能力4个方面的性能验证。

1 对象与方法

1.1对象 (1)方法符合率样本：经测序确认的分别包含13种病原体(甲型流感病毒、腺病毒、博卡病毒、鼻病毒、甲型流感病毒H1N1、副流感病毒、衣原体、偏肺病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体、季节性H3N2病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒)的临床咽拭子样本。(2)检出限样本：定值标准物质样本[参考品，由国家参考品(中国食品药品检定研究院)、慢病毒载体和质粒混合而成，包含所有13种病原体]。(3)交叉反应样本： 经测序确认的、包含7种病原体(包括表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、解脲支原体、巨细胞病毒、EB病毒)，但不包含待测试剂盒13种病原体的临床咽拭子样本。(4)抗干扰能力验证样本：经测序确认的弱阳性临床咽拭子样本2例(副流感病毒HPIV和冠状病毒HCOV)。测序工作委托上海生工生物公司完成，使用Sanger测序方法。测序仪器为ABI 3730xL；测序试剂为赛默飞BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit；测序使用3730默认的测序参数(Standard read DNA sequencing，POP7分离胶、36 cm毛细管)；将测序结果在NCBI网站上作BLAST对比分析。

1.2试剂和仪器 核酸提取或纯化试剂(宁波海尔施公司)；13种呼吸道病原体多重检测试剂盒(PCR毛细电泳片段分析法，宁波海尔施公司)；参考品[批号104190107001，由国家参考品(中国食品药品检定研究院，3700006-201501)、慢病毒载体和质粒混合而成，宁波海尔施公司]； SLA-32全自动核酸提取仪(台湾圆点奈米技术公司)，A300 PCR扩增仪(杭州朗基公司)，ABI 3500 Dx基因分析仪(英潍捷基公司)。

1.3临床咽拭子样本采集及核酸提取 使用专用的咽拭子取样后迅速放入装有3 mL采样液的采样管中，旋紧管盖。采样液中包含蛋白质稳定剂、阻止细菌和真菌生长的抗生素、缓冲液。将采样管置于涡旋混匀仪上充分涡旋10 s，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等。根据核酸提取试剂的要求，吸取300 μL样本并加入RT-PCR内参，用SLA-32核酸提取仪进行核酸提取和纯化。

1.4PCR扩增 PCR扩增体系共20 μL，包括14 μL PCR反应液，1 μL PCR酶液，5 μL核酸。在A300 PCR扩增仪上进行PCR扩增，反应条件：25 ℃ 5 min；50 ℃ 15 min；95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s(65 ℃开始，以1 ℃梯度降落退火，6个循环)；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s(29个循环)；72 ℃ 10 min。

1.5PCR产物的毛细管电泳分离 使用标准品(厂家提供)测量毛细管电泳平台中所有毛细管的荧光信号强度。毛细管电泳体系为9 μL AB Master Mix+1 μL PCR产物，用ABI 3500Dx 基因分析仪，选择“Fragment”电泳方法，进行PCR产物毛细管电泳分离。病原体特征峰为阳性时，检测结果判定为该病原体阳性。未出现病原体特征峰或病原体特征峰为阴性时，如果出现人DNA内参峰、人RNA内参峰和RT-PCR内参峰且3个内参峰高于毛细管标准品高峰(PosS)时，则检测结果判定为阴性；如果未出现人DNA内参峰和/或人RNA内参峰或峰高低于PosS峰高时，则考虑样本取样或保存不当，应重新取样进行提取检测；如果未出现RT-PCR内参峰或峰高低于PosS峰高时，则考虑检测失败，应重新对样本进行提取检测。病原体特征峰为灰区时，需从样本提取开始重新检测；灰区样本重新检测结果若位于灰区或阳性，则判定为该病原体阳性；重复检测结果若为阴性，则判定为该病原体阴性。

2 结果

2.1方法符合率 参比方法(测序)确认的20例临床咽拭子样本(阳性样本15例，阴性样本5例)，按照样本检测程序，用候选方法(待测试剂盒)和参比方法(测序)平行检测。结果显示，2种方法总符合率为100%，见表1。

表1 候选方法和参比方法结果比对

2.2检出限 定值标准物质样本由国家参考品(中国食品药品检定研究院)、慢病毒载体和质粒混合而成，包含所有13种病原体，见表2。在不同批内对该浓度样本进行20次重复测定(测定5 d，每天测定4份样本)。待测试剂盒检测结果阳性率为100%，故试剂盒能够达到说明书声称的最低检出限。

表2 检出限

2.3交叉反应 经测序确认的包含其他7种病原体(包括表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、解脲支原体、巨细胞病毒、EB病毒)但不包含待测13种病原体的临床咽拭子样本，用待测试剂盒检测5次，检测结果阴性率为100%，故试剂盒交叉反应验证合格。

2.4抗干扰能力 经测序确认的弱阳性临床咽拭子样本2例(副流感病毒HPIV和冠状病毒HCOV)，分别加入2组干扰物质溶液(5%的全血和1.2 mg/mL硫酸沙丁胺醇；终浓度为厂家声明的最高抗干扰浓度)，对照组加入等量的溶剂。全血处理组、药物处理组和对照组分别用待测试剂盒检测3次，结果符合率达到100%，故试剂盒抗干扰能力验证合格。

3 讨论

2019版指南用“检出限”代替旧版“测定下限”的概念。检出限一般指标本中一种分析物可被检出的最低含量，这一分析物含量可能不是量化的具体浓度[2]。本试剂盒规定的检出限样本的滴度：甲型流感病毒H1N1为0.098 TCID50/mL，由国家参考品S5稀释10 000倍得到；季节性H3N2病毒为0.1 TCID50/mL，由国家参考品S4稀释10 000倍得到；乙型流感病毒为2.0 TCID50/mL，由国家参考品S2稀释1 000倍得到；呼吸道合胞病毒、副流感病毒、冠状病毒、鼻病毒和偏肺病毒检测片段分别构建成慢病毒后，参照国家参考品进行TCID50标化定量，并稀释至各自检出限的滴度；博卡病毒、腺病毒、支原体和衣原体检出限样本为质粒稀释至各自检出限的滴度。

2019版指南用“交叉反应”代替旧版“特异性”的概念，明确了交叉反应应验证与检测对象可能存在交叉反应的核酸物质对检测的影响。对于病原体核酸检测来说，干扰现象主要指与检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状的病原体核酸。在本次性能验证过程中，我们根据说明书选取表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、解脲支原体、巨细胞病毒、EB病毒作为干扰病原体，这些病原体与待测病原体或具有同源性(如肺炎支原体和解脲支原体)、或引起相同或相似临床症状(呼吸道症状)。

2019版指南延用旧版“抗干扰能力”的概念。抗干扰能力是指临床样本中可能存在的干扰物质对检测结果不产生影响的能力。本次性能验证过程中，我们选择1.2 mg/mL硫酸沙丁胺醇和5%的血液作为干扰物质，因为硫酸沙丁胺醇是临床呼吸道疾病常见药物，而临床咽拭子样本中经常会掺杂一些血液，我们在实验室模拟了临床常见情况，结果证实试剂盒抗干扰能力合格。