miR-146a-5p通过调控TRAF6表达影响滋养细胞生物学行为*

陈芳荣， 郑林媚， 吴栋才， 龚护民

海南省人民医院(海南医学院附属海南医院)产科，海口 570311

子痫前期(preeclampsia，PE)是妊娠20周后出现的以高血压合并多脏器功能异常为主要表现的系统性疾病，在全球范围内发病率在5 %～10 %[1]。子痫前期是导致产科死亡的四大原因之一，严重影响母儿健康，是孕产妇、胎儿及新生儿死亡的重要原因。

尽管子痫前期的确切机制仍然未知，但越来越多的证据表明，子痫前期的主要病理原因是胎盘功能障碍，与内皮损伤和滋养细胞侵袭不足有关[2]。因此研究滋养细胞增殖、迁移和侵袭的分子机制可以为子痫前期的诊疗提供新的思路。

多数学者认为子痫前期滋养细胞侵袭能力的改变与绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblast cells，EVT)的行为改变有关。绒毛外滋养细胞之所以具有强大的侵袭功能，和它分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)有关，MMPs主要功能为通过降解和塑造细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，侵入子宫蜕膜的细胞外基质，整合到子宫肌层螺旋动脉壁内，调节滋养细胞的侵袭、迁移功能。而肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)可通过NF-κB和MAPK等多种通路影响MMPs[3]。

微小核糖核酸(miRNAs)是一类长度约为19～25 nt的单链非编码小分子RNA，广泛存在于动植物中，能在转录后水平上调节靶向基因的表达。miR-146a-5p是目前被研究得比较多的一种miRNA，它是最早被发现参与天然免疫的调控因子。通过生物信息学软件targetscan预测发现TRAF6也是miR-146a-5p的潜在靶基因。Hu等[4]研究发现，宫颈癌细胞中的miR-146a-5p通过抑制白细胞介素1受体相关激酶(IRAK1)和TRAF6来增强肿瘤细胞的生存能力。子痫前期的滋养细胞侵袭行为类似肿瘤细胞侵袭。但是，miR-146a-5p是否在子痫前期中异常表达，能否通过调节TRAF6的表达而影响其下游通路，改变滋养细胞的增殖能力，从而影响子痫前期的发展尚未见报道。

本文以人绒毛膜癌细胞株JEG-3细胞作为研究对象，经脂多糖(LPS)诱导后，检测miR-146a-5p在JEG-3细胞中的表达变化，探讨miR-146a-5p在子痫前期中的作用；通过观察miR-146a-5p表达水平的改变对预测靶基因表达、细胞增殖能力的影响，探讨miR-146a-5p是否可以通过调控TRAF6的表达而影响JEG-3细胞增殖能力。以期为深入研究子痫前期的发病机制提供有力的实验数据，并且为临床靶向治疗子痫前期提供参考及理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株和试剂

人绒毛膜癌细胞株JEG-3来源于国家实验细胞资源共享平台；Mimics NC、Inhibitor NC、miR-146a-5p inhibitor均购自上海吉凯基因公司，LPS购自美国Sigma公司，MEM培养液购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国Gibico公司，胰蛋白酶购自美国Genview公司，逆转录试剂盒及Real-time PCR试剂盒购自美国ABI公司；Trizol、脂质体2000(LipofectamineTM2000)、BAC试剂盒购自美国Invitrogen公司；CCK8和Transwell小室试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.2 细胞培养、分组和转染

JEG-3细胞用含10%胎牛血清的MEM培养液，在37℃、饱和湿度、5%CO2的孵箱中培养。取处于对数生长期的JEG-3细胞，用0.25%胰酶消化后细胞计数，按照密度为3×105个/孔接种到6孔板中，每孔细胞混悬液体积为2 mL。置于培养箱中继续培养16～24 h，细胞长至60%～80%瓶底面积时传代继续培养。将细胞设为4组：Mimics NC组、LPS组(0.5 μg/mL LPS处理JEG-3细胞制备体外子痫前期细胞模型)、Inhibitor NC组、miR-146a-5p inhibitor组。分别将2.5 μg不同质粒与5μL P3000加到250 μL无血清无双抗的基础培养液中混合，即预混液1；将5 μL Lipo2000转染试剂加入到250 μL无血清无双抗的基础培养液中，即预混液2；将预混液1和预混液2进行混合，室温放置10 min；将6孔板里的完全培养液弃掉，加500 μL无血清无双抗的基础培养液，随后将转染混合液缓慢加入到6孔板，轻轻前后晃动混匀；37℃，5% CO2下培养6 h后将培养液更换为相应的完全培养液，继续培养48 h。

1.3 实时荧光定量PCR技术定量检测基因表达

按照试剂盒操作说明，使用Trizol试剂从细胞中提取总RNA，并使用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板按Real-time PCR试剂盒说明进行PCR扩增。反应条件为预变性95℃ 3 min，变性95℃ 15 s，退火59℃ 20 s，延伸72℃ 30 s，扩增40个循环。60℃ 60 s，95℃ 15 s生成熔解曲线。引物序列为：miR-146a-5p上游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，下游引物5′-GG-TGAGAACTGAATTCCA-3′；TRAF6上游引物5′-AGCCTCCACCTCCACAAG-3′，下游引物5′-T-GACGCAAGACCACCAGAT-3′。以GAPDH为内参照，目的基因的定量分析采用2-ΔΔCt法计算。

1.4 Western blot检测蛋白的表达

蛋白提取：用生理盐水洗涤细胞，同时将其转移至1.5 mL的离心管中；加裂解液，于冰上裂解30 min。4℃下12000 r/min离心10 min；离心后的上清分装转移至1.5 mL离心管中，用于蛋白定量检测；BCA法进行蛋白定量。SDS-PAGE电泳：配制分离胶和浓缩胶，上样，电泳，转膜封闭，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜，显影；蛋白的相对表达量以目标蛋白与β-actin蛋白条带灰度值的比值反映。

1.5 CCK-8检测细胞增殖能力

取处于对数生长期，生长状态良好的各组JEG-3细胞，用0.25%胰酶消化后进行细胞计数。细胞接种到96孔板中，密度为7000个/孔，每孔细胞悬液体积为100 μL。细胞培养至状态稳定后，分别在第1～5天每孔加入10 μL CCK-8溶液，在37℃、5%CO2培养箱中培养4 h后，酶标仪于450 nm波长处测定各孔的吸光度(A)值。

1.6 划痕实验检测细胞迁移能力

各组JEG-3细胞分别接种于6孔板中，用200 μL移液器吸头顶端在孔板中心轴处沿直线轻轻划痕，划痕后用PBS洗涤去除划下的细胞，加入含2%血清培养液，放入37 ℃、5% CO2培养箱继续培养24 h。划痕闭合率(%)=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.7 Transwell实验检测细胞侵袭能力

收集各组转染后的JEG-3细胞，向Transwell上室加入5×104个细胞(稀释于不含胎牛血清的RPMI 1640培养液中)，下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，将Transwell小室置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱培养24 h后取出，擦去未穿透的细胞及Matrigel胶，4%甲醛固定，0.5%结晶紫染色。显微镜下随机选取5个不同的高倍视野，计数穿膜细胞数。每组设3个复孔，取均值，以穿膜细胞数代表细胞侵袭能力。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 Real-time PCR检测LPS诱导的JEG-3细胞中miR-146a-5p的表达水平

JEG-3细胞经LPS诱导后，与未予LPS刺激的空白对照组相比，miR-146a-5p表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 Real-time PCR检测LPS组和对照组miR-146a-5p的表达Fig.1 Real-time PCR analysis of the level of miR-146a-5p in LPS group and control group

2.2 Western blot检测LPS诱导的JEG-3细胞中TRAF6的表达水平

JEG-3细胞经LPS诱导后，与未予LPS刺激的空白对照组相比，TRAF6表达下调，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 Western blot法检测LPS组和对照组TRAF6的表达水平Fig.2 Western blotting analysis of protein level of TRAF6 in LPS group and control group

2.3 LPS和miR-146a-5p inhibitor对JEG-3细胞TRAF6蛋白表达的影响

与Mimics NC相比，LPS组的TRAF6蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与Inhibitor NC相比，miR-146a-5p inhibitor组的TRAF6蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与LPS组相比，miR-146a-5p inhibitor组的TRAF6蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见图3。

1：Mimics NC；2：LPS；3：Inhibitor NC；4：miR-146a-5p inhibitor图3 Western blot法检测各组细胞中TRAF6蛋白的表达水平Fig.3 Western blotting analysis of protein level of TRAF6 in each group of cells

2.4 LPS和miR-146a-5p inhibitor对JEG-3细胞增殖能力的影响

采用CCK-8法检测细胞增殖能力。与Mimics NC组相比，处理4 d后LPS组的细胞生长速率显著降低(P<0.05)；与Inhibitor NC组相比，处理4 d后miR-146a-5p inhibitor组细胞生长速率显著升高(P<0.05)。见图4。

与Inhibitor NC组比较，*P<0.05；与Mimics NC组比较，#P<0.05图4 CCK-8法检测各组JEG-3细胞增殖能力Fig.4 Detection of the proliferation of JEG-3 cells in each group by CCK-8 method

2.5 LPS和miR-146a-5p inhibitor对JEG-3细胞迁移和侵袭能力的影响

与Mimics NC组相比，LPS组的划痕闭合率和侵袭细胞数显著降低(均P<0.05)。与Inhibitor NC组相比，miR-146a-5p inhibitor组划痕闭合率、侵袭细胞数显著升高(均P<0.05)。与LPS组比，miR-146a-5p inhibitor组的划痕闭合率和侵袭细胞数明显升高(均P<0.05)。见图5、6。

1：Mimics NC；2：LPS；3：Inhibitor NC；4：miR-146a-5p inhibitor图5 划痕实验检测各组JEG-3细胞迁移能力Fig.5 Detection of migration of JEG-3 cells in each group by scratch test

1：Mimics NC；2：LPS；3：Inhibitor NC；4：miR-146a-5p inhibitor图6 Transwell法检测各组JEG-3细胞侵袭能力Fig.6 Detection of the invasiveness of JEG-3 cells by Transwell assay

3 讨论

子痫前期是孕产妇特有的综合征之一，且病因不明。从子痫前期的临床转归来看，终止妊娠并娩出胎盘是子痫前期最为有效的治疗方法，所以子痫前期是胎盘源性疾病这一观点已被广为接受，但其发病机制尚未完全阐明。子痫前期是孕产妇及围产儿死亡的重要原因，因此，找到子痫前期监测和防治的有效方法至关重要。

miRNAs在维持细胞正常活动、细胞的转化及肿瘤的发生中都起到关键作用。miRNAs具有高度保守性、组织特异性和疾病特异性，其通过对基因表达的调节来实现对细胞分化、发育和功能的调节，目前发现多达200个靶基因受miRNAs调控，且约有30%人类基因受miRNAs调控[5]。

人类miR-146a基因位于人类5号LOC285628基因的第2个外显子上(Chr.5q34)，是一个典型的多功能miRNA，在炎症、肿瘤、自身免疫性疾病等人体多种病理生理过程中发挥重要作用[6]。已经证实miR-146a-5p参与了肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭以及机体免疫反应等，在肿瘤的发生发展过程中起着重要作用，但是miR-146a-5p在不同肿瘤中所起的作用不尽相同。Wang等[7]研究发现miR-146a-5p在宫颈癌中的表达上调，miR-146a-5p过表达可以促进宫颈癌细胞增殖，表明miR-146a-5p在宫颈癌发生进程中表现出促癌作用。而Shomali等[8]却发现miR-146a-5p在胃癌中表达下调，miR-146a-5p下调促进幽门螺杆菌阴性胃癌细胞迁移。miR-146a-5p在自身免疫性疾病中也有差异表达。荀翠平等[9]发现miR-146a-5p、miR-155的表达水平与类风湿病情活动度评分呈正相关。miR-146a-5p在炎症反应中的重要作用也越来越受到重视，Tang等[10]发现，miR-146a通过TRAF6/p38 MAPK途径对促炎细胞因子的分泌起负性调节作用。

miR-146a-5p已被证实在炎症、免疫、肿瘤等多种生理和病理过程中发挥重要作用，但miR-146a在子痫前期中的作用尚未见报道。TRAF6在哺乳动物的发育、系统稳态以及免疫疾病的发生发展中也发挥着重要的作用，但TRAF6与子痫前期的关系也未见报道。此外，miR-146a-5p调控TRAF6在子痫前期中的作用机制亦未见报道。因此本研究通过体外实验探讨miR-146a-5p调控TRAF6在子痫前期发生、发展中的作用机制，以期为研究子痫前期的发病机制提供实验依据。

因为人绒毛膜癌滋养细胞系JEG-3细胞具有与滋养细胞相似的分子结构和生物学性状，故常代替正常滋养细胞用于研究其生物学行为。脂多糖(LPS)是革兰阴性菌外膜的主要成分，是炎症反应的主要活性成分[11]。Cotechini等[12]发现LPS诱发的炎症，导致胎盘亚硝化应激，肾脏结构和功能改变，平均动脉压升高，引起子痫前期和胎儿生长受限。Li等[13]研究发现在JEG-3细胞中，LPS通过上调环氧合酶-2(Cox-2)和相关炎症因子的表达激活了NF-κB信号通路，而JEG-3细胞的侵袭能力却被削弱。

本研究在体外采用LPS刺激的人绒毛膜癌滋养细胞系JEG-3细胞制作子痫前期滋养细胞模型。用Real-time PCR法检测发现miR-146a-5p在LPS诱导的JEG-3细胞中的表达较对照组升高，而Western blot检测显示TRAF6在LPS诱导的JEG-3细胞中的表达较对照组减少，且细胞增殖、迁移和侵袭能力均下降，说明LPS成功抑制滋养层细胞功能，与子痫前期的特点相符。

通过生物信息预测网站发现TRAF6是miR-146a-5p的靶基因之一，萤光素酶报告基因检测表明，miR-146a-5p可能与TRAF6的3′-UTR mRNA结合，然后下调其蛋白质表达[14-15]。因此我们推测，miR-146a-5p可能是通过调节TRAF6的表达，控制下游的信号通路，影响滋养细胞的增殖能力。本研究利用miR-146a-5p inhibitor干扰JEG-3细胞后，miR-146a-5p表达下降，而TRAF6表达上调，细胞的增殖、迁移和侵袭作用均明显增强，这表明，miR-146a-5p能通过下调TRAF6抑制JEG-3细胞的生物学功能。

本课题组前期研究发现，MMP2在子痫前期表达减弱[16]。MMPs是一类锌依赖性的蛋白水解酶，主要作用为降解Ⅳ型胶原蛋白。MMP-2/9表达增强可增加滋养细胞的迁移和侵袭能力[17]。TRAF6是细胞内信号转导通路上的关键接头蛋白，能间接或直接地与肿瘤坏死因子受体超家族和(或)白细胞介素-1(IL-1)/Toll样受体超家族成员结合，通过转录因子(PI3K)/AKT、AP-1、NF-κB、JNK/p38等通路的激活，影响细胞的功能，调控免疫、炎症、胚胎发育、氧化应激和骨代谢等多个生物学过程[18]。这在Zhang等[19]研究病毒感染的先天免疫应答中得到了验证：miR-146a的下调通过靶基因TRAF6增强Ⅰ型干扰素在体内外的应答来抑制a型流感病毒的复制。TRAF6是Toll样受体信号通路中的一个重要的蛋白质，在细胞凋亡中起着重要作用[20]。而且TRAF6蛋白是具有E3泛素化功能的[21]。因此，miR-146a-5p可能通过靶向抑制TRAF6的表达来影响JEG-3细胞的增殖能力。近来研究发现脐带间充质干细胞中相对保守的miRNAs(has-miR-146a-5p、has-miR-191-5p、has-miR-493-3p、has-miR-423-5p、has-miR-134-5p)有望成为合成外泌体类似物的组成部分[22]，用于疾病发展及治疗反应的监测等，同时它们还有可能发展成为临床药物递送载体。

综上所述，抑制miR-146a-5p表达后可上调TRAF6表达，增强JEG-3细胞增殖、侵袭及迁移能力。miR-146a-5p/TRAF6通路可能通过影响滋养细胞的生物学特性，进而促进子痫前期的发生、发展，本研究为子痫前期病情的早期监测及防治提供了临床靶点，也为下一步间充质干细胞用于子痫前期的治疗提供了理论依据。