新型H2S供体激活PI3K/Akt对癫痫大鼠脑内Bcl-2/Bax蛋白表达的影响*

张思远， 蔡 昕， 卢晓桦， 铁子慧， 叶芷钘， 刘丹琼， 都 昇， 雷水生， 朱晓琴△

1广州医科大学基础医学院生理学教研室，广州 5114362广州医科大学附属第五医院皮肤美容科，广州 510700

癫痫是常见的慢性、反复发作性神经系统疾病，影响全世界约1%的人口[1]。我国癫痫患者约为900万，每年新发病例约为50～60万，其发病率高，治愈率低，已成为我国严重的公共卫生问题。因此，寻找癫痫防治新靶点是神经科学研究的热点。目前常用抗癫痫药物多具有局限性和生物毒性[2-3]，探究新的癫痫治疗靶点，寻找一种新的、疗效确切、不良反应小的抗癫痫药物，是本研究的初衷。硫化氢(H2S)是经由PI3K/Akt信号通路传导的一种内源性气体介质，对细胞具有保护作用。研究表明，外源性给予硫化氢可保护实验性癫痫持续状态大鼠的海马神经元[4]。新型H2S供体(novel carbazole-based H2S)作为新兴神经元保护性气体信号分子的最佳给药形式，具有可缓释H2S的特性，可使作用部位药物浓度长期维持在较适宜的水平，对抗癫痫治疗药物的研究具有重要应用前景。PI3K/Akt通路是癫痫发病的重要信号转导通路，其下游的Bcl-2、Bax分别属于抗凋亡、促凋亡蛋白，在线粒体凋亡途径中起重要作用。Li[5]、Uzum[6]、张慧[7]等的研究发现PI3K/Akt信号通路参与了改善记忆、抗癫痫的神经保护作用。该通路已被证实在凋亡、免疫、炎症等领域与癫痫的发生相关[8]。既往研究表明，H2S对PI3K/Akt信号通路的作用位点包括影响Akt的磷酸化[9]、PI3K的磷酸化[10]。据此，H2S可能通过调节PI3K/Akt信号通路，在癫痫发作中起保护作用。但除此两个作用位点以外，H2S对该通路下游Bcl-2、Bax蛋白及对海马神经元凋亡的影响尚未见文献报道。本研究建立癫痫大鼠模型，检测不同处理组大鼠癫痫发作后凋亡指标和蛋白表达的变化，为论证H2S治疗癫痫的作用效果及其可能机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)购自Sigma公司；LY294002购自MedChemExpress(MCE)公司(美国)；兔抗大鼠PI3K、Bax、Bcl-2多克隆抗体，鼠抗Akt多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；TUNEL染色试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司。新型H2S供体合成方法：取N-乙基-3-咔唑羧基甲醛(200 mg，0.89 mmol)，HONH2·HCl(61.9 mg，0.89 mmol)，AcONa(72.9 mg，0.89 mmol)，加入磷酸二硫代二乙酯(165.5 mg，0.89 mmol)及60 mL二恶烷，将反应混合物回流5 h，在真空中蒸发溶剂，以柱层析法对其残渣进行纯化(乙醚∶乙酸乙酯=20∶1)，得率为86%。

1.2 实验分组

成年健康SD(Sprague-Dawley)大鼠30只，雄性，体重(200±50)g，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验室常规条件下饲养。实验动物随机分为5组，其中1组作为正常对照(Control组)；4组复制癫痫持续状态(status epilepticus，SE)模型，再根据处理不同分为PTZ致痫组(SE组)、H2S预处理组(H2S+SE组)、DMSO预处理组(DMSO+SE组)、抑制剂预处理组(LY294002+SE组)。每组6只大鼠。

1.3 模型制备

SE模型制备采用首剂1% PTZ(40 mg/kg)腹腔注射，注射后观察大鼠行为学变化，若10 min后无SE典型表现，以原始剂量的半量(20 mg/kg)注射，评估方法同前，之后每隔10 min补加小剂量PTZ(10 mg/kg)，直至诱导SE模型成功即停止给药。根据Racine癫痫发作标准做行为学评估，模型成功标志为在30 min内≥3次Ⅳ～Ⅴ级发作。正常对照组大鼠给予腹腔注射等剂量生理盐水。H2S预处理组在造模前4 h侧脑室注射新型H2S 10 μL(500 μmol/L)，DMSO预处理组在造模前4 h侧脑室注射10 μL DMSO，抑制剂预处理组在造模前4 h侧脑室注射PI3K抑制剂LY294002 10 μL(1 μg/μL)，SE组和Control组于同一时间侧脑室注射等量生理盐水(10μL)。

1.4 行为学观察

根据Racine癫痫发作标准评估大鼠急性SE模型是否造模成功并记录发作级别与发作潜伏期。

1.5 脑电检测

定位海马位置(大脑左侧前囟后3.8 mm，矢状缝旁2.5 mm)，钻开颅骨并穿过硬脑膜，将不锈钢双极铜芯电极插入硬膜下3.0 mm。术后缝合部分皮肤，以活力碘消毒皮肤预防感染，将大鼠置于空笼内，30 min后待大鼠清醒，分组诱导SE模型，将引导电极信号通过BL-420生物机能实验系统记录海马脑电信号。

1.6 TUNEL法检测各组大鼠海马组织中细胞凋亡情况

于模型制备成功后4 h每组各取2只大鼠，麻醉处死后取全脑组织，OCT包埋，冰冻切片，厚度约40 μm。切片以多聚甲醛固定，蛋白酶K通透处理，滴加PBS孵育，以TdT孵育缓冲液37℃恒温孵育1 h，PBS冲洗3次，吸弃残余PBS液，以抗荧光淬灭封片液和封片油封片，在倒置荧光显微镜下观察海马神经元CA1区域。凋亡细胞核被染成绿色，于高倍镜下随机计数5个视野并计数凋亡细胞。

1.7 Western blot法检测各组大鼠脑组织中PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达

于模型制备成功后4 h每组各取3只大鼠，麻醉处死后各取50 mg海马组织，研磨后加入含蛋白酶抑制剂的裂解液，于4℃下13000 r/min离心15 min，取上清，用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白纯度和浓度进行检测。所提取蛋白经99℃煮5 min变性，再进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离的蛋白条带电转移至PVDF膜上，4℃下以5%牛血清蛋白封闭2 h，将一抗兔抗大鼠PI3K、Bax、Bcl-2多克隆抗体及鼠抗Akt多克隆抗体加入(稀释度均为1∶1000)，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入二抗(稀释度1∶1000)，室温下孵育1 h，TBST洗涤3次，加入ECL化学发光试剂，避光反应并拍照，利用Image J图像分析软件以GAPDH蛋白为参考获得PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠行为学观察

复制SE模型的大鼠在注射PTZ后，依次表现为Ⅰ到Ⅴ级发作，部分严重发作的大鼠可以观察到四肢角弓反张，尾强直，甚至抽搐死亡。共24只大鼠造模，5只因剧烈抽搐死亡，2只未点燃成功，其余17只大鼠均达到Ⅳ～Ⅴ级发作状态，且在30 min内均有>3次发作，造模成功率为70.8%。

正常对照组无发作；SE组与DMSO+SE组的发作潜伏期及发作级别无明显差异；与SE组比较，H2S+SE组癫痫发作潜伏期延长(P<0.01)，而抑制剂预处理组(LY294002+SE组)癫痫发作潜伏期缩短(P<0.05)，见表1。

表1 癫痫发作至Ⅳ级及以上的潜伏期及持续时间Table 1 Incubation period of the rats with epileptic seizure

2.2 脑电图波形

脑电结果显示(图1)，正常对照组为正常脑电图波，SE组记录到棘波、尖波等痫样波。SE组痫样波波幅[(69.5±10.4)mV]与DMSO+SE组[(71.4±7.4)mV]差异无统计学意义(P=0.756)；H2S+SE组痫样波波幅[(27.1±1.8)mV]较SE组降低(P=0.001)，LY294002+SE组痫样波波幅[(100.2±20.7)mV]较SE组增高，差异有统计学意义(P=0.018)。

图1 各组大鼠海马脑电记录图Fig.1 Hippocampal electroencephalogram of rats in each group

2.3 TUNEL检测细胞凋亡

大鼠海马切片TUNEL染色结果显示，正常对照组5个高倍镜视野下的平均凋亡细胞数最少(10.2±1.3)，SE组(56.0±7.0)和DMSO+SE组(58.8±6.1)的凋亡细胞数均较对照组显著增加(均P<0.01)。与SE组比较，H2S+SE组凋亡细胞数明显减少(34.6±5.9，P=0.01)，LY294002+SE组凋亡情况最为严重(111.8±17.2)。见图2。

箭头所示为被TUNEL试剂染成绿色荧光的凋亡海马神经元细胞核图2 TUNEL染色荧光切片Fig.2 Fluorescence section with TUNEL staining

2.4 Western blot检测结果

Western blot检测结果显示(图3)，SE组与DMSO+SE组各蛋白表达量无统计学差异(均P>0.05)，PI3K、Akt、Bcl-2、Bax表达量从高到低均依次为H2S+SE组、DMSO+SE组及SE组、LY294002+SE组、Control组。与SE组比较，Bcl-2/Bax比值在H2S+SE组显著升高(P<0.05，图4)。

1：Control组；2：H2S+SE组；3：LY294002+SE组；4：DMSO+SE组；5：SE组图3 Western blot检测各蛋白在大鼠海马组织中的表达Fig.3 Expression of proteins in hippocampal tissues of rats detected by Western blotting

1：Control组；2：H2S+SE组；3：LY294002+SE组；4：DMSO+SE组；5：SE组；与SE组比较，*P<0.05；与Control组比较，△P<0.05图4 各组Bcl-2/Bax比值比较Fig.4 Relative expression ratio of Bcl-2/Bax

3 讨论

已有研究显示，癫痫发作后神经元凋亡是非常重要的损伤形式，而海马特别容易受到癫痫引起的损伤[11]。当前研究表明，癫痫后伴有神经细胞的凋亡和缺失，Sloviter等[12]和Cavazos 等[13]分别在在颞叶癫痫患者大脑和各种不同的癫痫动物模型中，观察到长期的癫痫发作造成海马锥体细胞大量减少、胶质细胞增生，形成海马硬化。另一方面，癫痫引起海马神经元凋亡丢失，将进一步引起癫痫反复发作，故患有癫痫诱发海马损伤的动物会经历更频繁且严重的癫痫发作[14]。本实验中，行为学和脑电图证实癫痫发作的SE组与正常对照组相比较，神经元凋亡细胞数增多，提示癫痫促进凋亡；而LY294002+SE组的抗凋亡通路被抑制，与SE组比较，其海马组织凋亡加重，其脑电图波幅升高、癫痫发作潜伏期缩短，直接提示神经元凋亡在癫痫发作中的正向效应。横向比较，5组海马神经元凋亡情况均与行为学观测结果和脑电图波幅变化正相关，再次说明凋亡极有可能是影响癫痫发作程度的重要因素。基于此，我们可以认为癫痫引起的海马神经元凋亡和丢失与癫痫的进一步加重和反复发作是互为因果而相互促进的。

Henshall等[15]认为阻断细胞凋亡是一种神经保护机制，但其不良反应限制了临床上用于治疗长期或复发性癫痫，否则可能成为一种新的神经保护的替代方法。这也意味着干预凋亡通路可能是一种具有潜在价值的辅助神经保护或抗癫痫策略。而新型H2S供体作为一种新型分子干预形式，结合了H2S分子的药理特点和探针形式的优点。一方面，H2S可通过激活PI3K/Akt信号通路而改变Bcl-2/Bax比值，减小神经元凋亡指数，保护神经功能[16]。另一方面，作为亲脂性气体的载体，新型H2S供体给药方便，可自由通过细胞膜激活PI3K/Akt通路而不需结合胞膜受体，决定了它比之其他药物更灵活。同前所述，研究已证实PI3K/Akt通路参与了改善记忆、抗癫痫的神经保护作用[5-6]，而H2S对该通路有激活作用[4，10]。在本研究中，Western blot实验显示与SE组相比，H2S+SE组PI3K、Akt表达量，Bcl-2/Bax比值均升高，TUNEL染色示凋亡情况改善，行为学和脑电图示癫痫发作程度减轻，同上述研究所得结果一致。而PI3K通路抑制后上述蛋白表达量下降，也从反面论证了这一点。从H2S+SE组、SE组到LY294002+SE组，PI3K通路激活程度从高到低，凋亡和癫痫发作情况从轻到重，有力支持了H2S可通过改善神经元凋亡的保护作用从而抑制癫痫的观点。

大多数硫化氢的相关研究是以硫化物盐(NaHS和Na2S)为供体进行的，但由于其易被氧化为硫烷硫而并不适用于临床。与传统的供体硫氢化钠相比，新型芳基硫代酰胺类H2S供体更为稳定，同时还具有缓释的特性，能使H2S相对稳定在生理浓度发挥效应，同时能避免传统硫化氢供体快速释放H2S导致浓度过高，从而引起如血压下降过快等不利影响。此外，经过动物和分子实验发现新型H2S供体具有良好的安全性和细胞成像能力，适用于基础研究和对临床应用的探索。

癫痫的凋亡相关发病机制可能是：神经元异常同步放电致使癫痫初次发作，海马神经元受损凋亡，引起丢失；数量减少的海马神经元同步异常放电的次数增加，癫痫发作加重或反复发作；癫痫发作后机体内源性H2S代偿性增加，激活PI3K/Akt通路，(此时外源性补充生理浓度的H2S可增加通路的激活程度)，一方面促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，进而抑制Ca2+内流和Cyt C向胞内转移；另一方面可抑制促凋亡蛋白Bax的表达并进一步抑制其与线粒体外膜上的离子通道相结合，进而抑制Cyt C、Caspase酶原向胞内转移[17]；在这个过程中，Bcl-2可通过竞争性结合抑制Bax的功能。这两方面作用的共同结果将抑制凋亡启动复合物的产生，从而抑制海马神经元的凋亡[18]，进一步抑制癫痫的反复发作和程度加重。在此过程中，癫痫发作可以被部分看作是由凋亡引起的级联放大效应，凋亡程度越大将更加重癫痫发作程度，反过来又进一步导致海马神经元的丢失。而外源性补充生理浓度的硫化氢则是阻止这一过程、防止神经元进一步损伤的保护因素。综上所述，H2S可能通过激活PI3K/Akt通路改变其所介导的凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达，从而升高Bcl-2和Bax的比值而减少海马神经元的凋亡，进而起到对海马神经元的保护作用和抑制癫痫的治疗作用。