DNA甲基化转移酶DNMTs和甲基化结合蛋白MBDs在卵巢子宫内膜异位症中的表达及相关性研究*

王礼贤， 李 琰， 康 山

河北医科大学第四医院 1妇产超声科 2分子生物室 3妇科，石家庄 050011

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是一种常见的妇科病，是具有生长活性的子宫内膜组织出现在子宫腔以外的地方而引起的疾病，约10%～15%的育龄期妇女患有此病，且发病率呈逐年上升趋势。EMs临床症状以痛经、性交痛、月经异常和不孕多见，严重影响患者的生活质量和身心健康[1]。尽管已有多种学说和理论阐述EMs的病因，但其确切发病机制仍不明确。近年来，越来越多的证据表明EMs可能是一种表观遗传学疾病，患者在位内膜和异位内膜中存在许多异常甲基化基因[2]。DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)是DNA甲基化过程中的关键酶，与DNA甲基化活性密切相关[3]。甲基化结合蛋白(methyl-CpG-binding domains，MBDs)在DNA甲基化过程中也起到了桥梁性的作用[4]。因此，本研究采用qRT-PCR技术检测卵巢子宫内膜异位症患者的在位内膜和异位内膜中DNMTs和MBDs的mRNA表达水平及其相关性，探讨DNMTs和MBDs在EMs发生中的可能作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2013年9月～2015年12月期间就诊于河北医科大学第四医院妇科，行腹腔镜手术治疗并经病理检查证实为卵巢子宫内膜异位症的患者20例(平均年龄37.53±7.29岁)，分别取其子宫在位内膜及异位内膜(巧克力囊肿壁)；另选取同期因宫颈上皮内瘤变Ⅲ级在本院行全子宫切除术的患者20例(平均年龄39.94±6.61岁)，取其子宫内膜为对照内膜，术后经病理检查证实为正常的子宫内膜组织。两组患者年龄差异无统计学意义(P<0.05)。所有入选者既往月经规律，3个月内未接受过激素治疗，所取内膜组织均为分泌期内膜，且除外子宫内膜单纯性或复杂性增生、息肉等子宫内膜病变。所有参与者均已签署知情同意书。

1.2 标本采集

术中无菌采集卵巢子宫内膜异位症患者的在位内膜和异位内膜及对照组的子宫内膜组织，放入RNAlater溶液(Carlsbad，美国)中，-20℃保存。

1.3 RNA抽提和qRT-PCR检测

分别取各组异位内膜、在位内膜及正常内膜组织，采用Trizol试剂盒(捷瑞，上海)提取总RNA，反转录试剂盒(Thermo，美国)进行反转录(总反应体积10 mL，42℃ 60 min)，70℃15 min灭活反转录酶，-20℃保存或立即使用荧光定量PCR扩增试剂盒(Qiagen，德国)以qRT-PCR仪(ABI，美国)采用二步法进行PCR扩增。依次加入Mix 10 μL，上下游引物各1.4 μL，Rox 0.1 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 6.1 μL至最终体积20 μL，混匀离心。反应条件设定为预变性95℃15 min，94℃15 s，60℃30 s，72℃35 s，40个循环。各引物序列(表1)采用Primer 5在线软件设计，并由上海生工生物工程技术有限公司合成。每个标本设置3个复孔。以GAPDH为内参，根据2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

表1 qRT-PCR的引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析。数据呈非正态分布，用中位数(四分位数间距)表示，各组间比较采用非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义。相关性分析采用Pearson相关分析，以P<0.05表示二者之间有相关性。

2 结果

2.1 3组子宫内膜中DNMT1、DNMT3A及DNMT3B的mRNA表达水平比较

DNMT1 mRNA在对照内膜、在位内膜和异位内膜中的相对表达量分别为：0.0122(0.0103～0.0220)、0.0038(0.0024～0.0061)、0.0043(0.0034～0.0056)，其中，在位内膜和异位内膜的DNMT1 mRNA表达明显低于对照内膜，差异均有统计学意义(P<0.01，P=0.031)，而在位内膜与异位内膜的表达量差异无统计学意义(P=0.464)；DNMT3A mRNA在对照内膜、在位内膜和异位内膜中的相对表达量分别为：0.0111(0.0059～0.0141)、0.0034(0.0021～0.0056)、0.0044(0.0029～0.0075)，其中，在位内膜和异位内膜的DNMT3A mRNA表达明显低于对照内膜，差异均有统计学意义(P=0.001，P=0.027)，而在位内膜与异位内膜的差异无统计学意义(P=0.796)；DNMT3B mRNA在对照内膜、在位内膜和异位内膜中的相对表达量分别为：0.0013(0.0007～0.0027)、0.0007(0.0004～0.0010)、0.0006(0.0003～0.0009)，其中，在位内膜和异位内膜的DNMT3B mRNA表达量明显低于对照内膜，差异均有统计学意义(P=0.005，P=0.020)，而在位内膜与异位内膜的差异无统计学意义(P=0.676)。见图1。

*P<0.05,**P<0.01图1 3组内膜中DNMTs的mRNA表达水平比较Fig.1 Comparison of DNMTs mRNA expression levels in the endometrium of the three groups

2.2 DNMT1、DNMT3A及DNMT3B mRNA表达水平之间的相关性

DNMT1、DNMT3A及DNMT3B的mRNA表达水平呈一定程度的两两正相关。其中，DNMT1与DNMT3A的相关性系数r为0.370(P=0.006)；DNMT1与DNMT3B的相关性系数r为0.306(P=0.025)；DNMT3A与DNMT3B的相关性系数r为0.287(P=0.035)。

2.3 3组内膜中MBD1、MBD2、MBD3及MBD4的mRNA表达水平比较

MBD1 mRNA在对照内膜、在位内膜和异位内膜中的相对表达量分别为0.0281(0.0160～0.0359)、0.0210(0.0103～0.0396)、0.0099(0.0085～0.0115)，其在异位内膜的表达水平明显低于在位内膜和对照内膜，差异均具有统计学意义(P=0.027，P<0.01)，在位内膜与对照内膜的差异无统计学意义(P=0.540)；MBD2 mRNA在对照内膜、在位内膜和异位内膜中的相对表达量分别是0.0723(0.0461～0.1185)、0.0320(0.0212～0.0475)、0.0283(0.0188～0.0578)，其在在位内膜和异位内膜中的表达水平均明显低于对照内膜，差异均具有统计学意义(P=0.002，P=0.003)，异位内膜与在位内膜的差异无统计学意义(P=0.828)；MBD3 mRNA在对照内膜、在位内膜和异位内膜中的相对表达量分别是0.0170(0.0092～0.0279)、0.0032(0.0023～0.0040)、0.0137(0.0063～0.0164)，其在在位内膜和异位内膜的表达水平均明显低于对照内膜，差异具有统计学意义(均P<0.01)，在位内膜与异位内膜的差异无统计学意义(P=0.602)；MBD4 mRNA在对照内膜、在位内膜和异位内膜中的相对表达量分别是0.0314(0.0230～0.0520)、0.0306(0.0194～0.0438)、0.0319(0.0179～0.0866)，3组间差异无统计学意义(P=0.596)。见图2。

*P<0.05，**P<0.01图2 3组内膜中MBDs的mRNA表达水平比较Fig.2 Comparison of MBDs mRNA expression levels in the endometriums of the three groups

2.4 MBD1、MBD2、MBD3及MBD4 mRNA表达水平之间的相关性

MBD1与MBD2、MBD3及MBD4 mRNA表达水平之间无明显的相关性，相关系数r分别为0.279(P=0.103)、0.028(P=0.831)、0.134(P=0.308)；MBD2与MBD3 mRNA表达水平之间呈正相关，相关系数r为0.326(P=0.011)；MBD2与MBD4 mRNA表达水平之间无明显相关性，相关系数r为0.057(P=0.665)；MBD3与MBD4 mRNA表达水平之间无明显相关性，相关系数r为0.167(P=0.201)。

2.5 DNMTs与MBDs mRNA表达水平之间的相关性

MBD2与DNMT1、DNMT3A之间呈一定程度的正相关，相关系数r分别为0.294(P=0.027)、0.261(P=0.048)，其余两两之间无明显相关性，详见表2。

表2 DNMTs与MBDs mRNA表达水平之间的相关性Table 2 Correlation between DNMTs and MBDs mRNA expression levels

3 讨论

DNA甲基化是真核细胞基因表达调控的主要方式之一，在胚胎发育、组织分化、肿瘤及其它疾病发生和发展中发挥了重要作用，越来越多的证据表明EMs患者的在位内膜和异位内膜中存在许多基因，由于DNA甲基化水平的改变导致其表达异常，使参与EMs相关的激素和炎症因子发生改变，从而在EMs的发生和发展中起了一定的作用[5]。

DNMTs是DNA甲基化过程中的关键酶，其家族成员主要包括DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。DNMT1是一种维持甲基转移酶，对于维持DNA甲基化水平非常重要。DNMT3A和DNMT3B是从头合成的甲基转移酶，主要参与构建甲基化[6]。Rhee等[7]认为体内DNMTs被破坏时，其活性几乎消失，从而导致基因组低甲基化。EMs患者的在位和异位内膜中DNMTs异常表达可影响DNA的甲基化水平及后期转录合成，从而影响EMs的发生和发展。以往的研究表明EMs患者的在位和异位内膜中DNMTs存在着异常表达，但结果不一。Wu等[8]研究发现，与EMs患者的在位内膜相比，其异位内膜中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的mRNA水平均升高。Szczepanska等[9]认为，与正常内膜相比，EMs患者的在位内膜中DNMT3A mRNA表达升高，其他DNMTs表达水平不变。本研究发现EMs患者的在位内膜和异位内膜中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达均低于正常内膜。Van Kaam等[10]报道，EMs患者的在位和异位内膜中DNMT1和DNMT3B表达水平明显低于正常内膜，这一结论与我们的结果一致。对于学者们不同的研究结果，笔者认为可能是由于人群不同、标本不同及样本量不同所致。本研究的对象为中国华北地区女性分泌期的子宫内膜组织，而其他研究有些是增殖期子宫内膜，有些则是纯化的子宫内膜上皮细胞。此外，Hermann等[11]认为正常的DNA甲基化水平需要DNMTs三者联合起来共同维持，即DNMT1的维持甲基化功能可以保证DNMT3A和DNMT3B重新甲基化程序的启动，而DNMT3A和DNMT3B又可以提升整体的甲基化水平。Rhee等[7]研究发现单独破坏DNMT1或DNMT3B不会改变结直肠癌细胞中的特异性甲基化，只有当两者同时都被破坏时，大部分基因组的DNA甲基化才被消除。我们的研究首次研究了DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达水平之间的相关性，结果发现DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达水平之间确实呈一定程度的正相关。

DNA甲基化过程中，除了DNMTs发挥转移酶的作用之外，还需MBDs特异性识别甲基化位点，招募组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)至该区域，引起染色质结构发生变化，从而抑制基因转录[12-13]。本研究探讨了MBDs家族中的MBD1、MBD2、MBD3及MBD4在EMs患者的在位和异位内膜中的mRNA表达水平。这也是首次在EMs中将4成员结合起来进行研究。

本世纪初，Shiraishi等[12]就发现MBD1可选择性地与单个甲基化CpG位点结合，抑制基因转录。近年来研究发现MBD1也能与未发生甲基化的CpG位点结合而抑制转录[14]。换言之，不论甲基化水平如何，MBD1都能够翻译转录CpG二核苷酸的信号，从而介导转录抑制[15]。已发现MBD1在许多恶性肿瘤组织和细胞系中的表达均升高，如结肠癌和胰腺癌等[16]。MBD2能招募HDAC至甲基化CPG位点，引起组蛋白去乙酰化从而引发基因沉默[4]。MBD3的作用是在MBD2存在的条件下被招募至甲基化位点，二者相互作用从而增强MBD2与甲基化DNA的亲和力[17]。MBD4能结合单个对称甲基化CpG位点，识别CpG位点错配的T并进行修复，维持基因组的稳定性[18]。本研究结果表明EMs异位内膜中MBD1 mRNA表达水平明显低于在位内膜和对照内膜，而在位内膜与对照内膜的表达差异无统计学意义；在位内膜与异位内膜中MBD2与MBD3的mRNA表达水平均明显低于对照内膜，而异位内膜与在位内膜之间无显著差异；MBD4 mRNA在3组内膜中的表达水平无显著差异。以往的研究表明，EMs患者的在位和异位内膜中MBDs mRNA表达水平与正常内膜存在差异，但结果也不一致。其中，Van Kaam等[10]研究认为EMs患者的在位和异位内膜中MBD1与MBD2 mRNA异常表达，与本研究结果一致。而林晓斌等[19]却认为EMs患者的异位内膜中MBD2 mRNA表达水平高于在位内膜。通过相关性分析，我们还发现MBD2与MBD3 mRNA的表达水平呈正相关，笔者认为其原因可能是由于MBD3可与MBD2相互作用，从而增强MBD2与甲基化DNA的亲和力所致。Pontes等[20]发现胃癌组织中MBD2和MBD3的mRNA表达较正常胃黏膜组织均明显减少。此外，Stirzaker等[21]报道，MBD2可以与DNMT1和DNMT3A结合，在特定区域中的易患癌甲基化频谱的改变上发挥了关键性作用。本研究也同样发现MBD2与DNMT1、DNMT3A mRNA表达水平之间呈不同程度的正相关。这意味着MBD2除了发挥自身作用之外，还可能与DNMT1和DNMT3A之间相互作用，从而参与EMs中异常DNA甲基化水平的维持与调节。

综上所述，本研究发现EMs患者的在位内膜和异位内膜中存在DNMTs与MBDs mRNA的异常表达，并且各DNMTs mRNA的表达水平之间，以及MBD2与MBD3、DNMT1、DNMT3A的mRNA表达水平之间均呈正相关，这为进一步了解了DNA甲基化异常在EMs病因中的作用提供了理论依据。