红景天苷-胶原蛋白海绵支架的构建及其对大鼠皮肤创伤的修复作用▲

温玉莹 钟燕南 梁佳欣 周竞扬 朱 桐 王贤君 符腾越 周清清 彭新生 周艳芳

(广东医科大学1 基础医学院，2 药学院，东莞市 523808，电子邮箱：576948912@qq.com)

皮肤创伤修复是一个复杂的过程，涉及多种细胞的协同作用，修复过程中任何的失败均可能导致慢性伤口和瘢痕形成，给患者带来极大的痛苦[1]。皮肤组织工程技术可达到修复创伤和重建功能的目的，并可解决自体植皮术来源受限的问题。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，具有很强的生物活性及生物功能，也是一种天然的组织支架材料，被广泛用于创伤修复[2]。红景天苷是中药红景天的主要成分之一，可抗氧化、抗衰老，对心血管、神经、皮肤等组织有一定的保护作用[3]。本实验利用胶原蛋白作为天然组织支架材料和药物载体，构建红景天苷-胶原蛋白海绵支架，并通过动物实验评价其对皮肤创伤修复的效果，为创伤修复的基础研究和临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康的无特定病原体级雄性SD大鼠24只，6～8周龄，体重180～220 g，由南方医科大学实验动物中心提供，动物许可证号:SCXK(粤)2015-0147。于(25.0±2.0)℃室温下，使用普通大鼠饲料喂养。

1.2 主要试剂及仪器 红景天苷(南京道斯夫生物科技有限公司，批号：190320H)；胶原蛋白(牛跟腱中提取)由本实验室自制；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色试剂(南京建成生物工程研究所，批号：20190321)；青链霉素混合液(北京索莱宝科技有限公司，批号：20181217)。高效液相色谱仪(日本岛津公司，型号：LC20A)；真空冷冻干燥机(宁波新芝生物科技有限公司，型号：SCIENTZ-10N)；数控超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司，型号：KQ5200DB)；扫描电子显微镜(日本JEOL公司，型号：JSM-6390LV)；离子溅射仪(北京中科科仪股份有限公司，型号：SBC-12)。

1.3 红景天苷-胶原蛋白海绵支架及胶原蛋白海绵支架的制备 按文献[4-5]的方法提取纯化胶原蛋白。取23.88 g的8 mg/g胶原蛋白溶液与0.12 g红景天苷混合，充分搅拌。将混合所得胶原混合物注入12孔培养板中，每孔2 g。随后将其置于-20℃中冷冻12 h，取出后立即放入真空冷冻干燥机中真空干燥24 h，制成直径约2 cm的红景天苷-胶原蛋白海绵支架，每块支架约含10 mg的红景天苷。采用相同方法，将24 g的8 mg/g胶原蛋白溶液按每孔2 g注入12孔培养板中并冷冻干燥，制得无药物装载的胶原蛋白海绵支架。

1.4 红景天苷-胶原蛋白海绵支架相关检测指标

1.4.1 支架的结构表征：将红景天苷-胶原蛋白海绵支架样品撕取小块后通过双面导电胶固定在样品台上，然后进行溅射喷金处理，处理后采用扫描电子显微镜在加速电压下观察其表面与断面结构。

1.4.2 支架的孔隙率：采用乙醇渗透法测定支架的孔隙率。将体积为10 mL的离心管装满乙醇并称重(记为W1)，支架称重(记为Ws)后浸入装满乙醇的离心管内，放入超声仪超声30 min，然后再加满乙醇并称重(记为W2)。将吸满乙醇的样品取出后，将剩余的乙醇和离心管称重(记为W3)。同时将无药物装载的胶原蛋白海绵支架作为对照组,实验重复3次取均值。计算孔隙率，孔隙率=(W2-W3-Ws)/(W1-W3)×100%。

1.4.3 支架的体外药物释放度：将红景天苷-胶原蛋白海绵支架完全浸入10 mL磷酸盐缓冲溶液中，置于37℃恒温摇床。置于恒温摇床后开始计时，于5 min、10 min、20 min、30 min、60 min、120 min分别取样保存。采用高效液相色谱法检测溶液中的药物含量，计算累积释放度。通过梯度浓度的红景天苷样品的峰面积求出标准曲线(Y=3×106X+13472，其中X为浓度，Y为峰面积)，然后根据标准曲线计算不同时间的药物释放度，累计加和后计算累积释放度。色谱条件：色谱柱为Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为水-甲醇(85 ∶15)；流速为1.0 mL/min；检测波长为275 nm；柱温为30℃；进样量5 μL。实验重复3次取均值。

1.5 动物模型制备与分组 按随机数字表法将24只SD大鼠分为模型组、胶原蛋白海绵支架组和红景天苷-胶原蛋白海绵支架组，每组8只。各组大鼠以10%水合氯醛(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20170110)腹腔注射(0.4 mL/100 g)麻醉后，背部备皮并用碘附消毒，在背部正中线两侧用手术刀各切除一个直径为2 cm的全层圆形皮肤创口，并将每组切除后的正常皮肤固定包埋行HE染色。模型组创口不做其他处理，仅用纱布包扎，其他两组分别用胶原蛋白海绵支架组、红景天苷-胶原蛋白海绵支架组植入大鼠皮肤创面，并用医用胶布包扎。待大鼠苏醒后分笼饲养，造模后3 d腹腔注射青霉素-链霉素双抗0.5 mL/(100 g·次)，1次/d，连用3 d，以防止伤口感染。

1.6 大鼠的观察指标

1.6.1 一般情况：术后观察各组大鼠存活情况、有无感染以及创口愈合情况。

1.6.2 创伤愈合率：造模后第7、14、21、28天，每组随机取2只大鼠测量4个创口面积，用半透明塑料薄膜贴附于创口后分别沿边缘描记和拍照，将照片扫描入计算机，通过Image-Pro Plus软件测算愈合面积，其中造模成功后的面积为原创面面积。愈合率(%)=(原创面面积-现创面面积)/原创面面积×100%。

1.6.3 组织病理学变化：造模后第7、14、21、28天，每组测量创伤愈合率后处死2只大鼠，取包括整个创面及其周边5 mm的全层组织，将组织块置于4%中性多聚甲醛中固定24 h。随后常规石蜡包埋后备用。蜡块常规脱水、包埋，切片后行HE染色，光镜下观察组织病理学变化。此外，在造模后第28天，将每组2只大鼠的4张切片，在40倍光学显微镜下分5个视野，每个视野测量1次新生上皮厚度，取平均值。

1.7 统计学分析 使用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 红景天苷-胶原蛋白海绵支架大体外观及电镜下结构 海绵支架色泽洁白，柔软疏松(图1A)。电镜下可观察到内部具有高度互联的多孔结构，孔与孔之间呈紧密排列状态，孔径大小在40～200 μm范围(图1B)。

图1 红景天苷-胶原蛋白海绵支架外观图(A)与扫描电镜图(B)

2.2 红景天苷-胶原蛋白海绵支架孔隙率 红景天苷-胶原蛋白海绵支架与单纯胶原蛋白海绵支架的孔隙率分别为(71.359±4.057)%、(64.930±2.359)%，差异无统计学意义(t=2.373，P=0.077)。

2.3 红景天苷-胶原蛋白海绵支架的药物体外累积释放率 红景天苷-胶原蛋白海绵支架中的红景天苷在体外能快速释放，在30 min基本释放完全，这说明胶原蛋白海绵支架并不影响红景天苷药物释放。见图2。

图2 红景天苷-胶原蛋白海绵支架体外红景天苷累积释放率

2.4 3组大鼠一般情况及创口愈合率 各组大鼠均未出现创口感染及死亡。随着时间推移，3组的创口愈合率都呈增加的趋势(均P<0.05)。在各个时间点，两种海绵支架组的创口愈合率均大于模型组(均P<0.05)，在第14天红景天苷-胶原蛋白海绵支架组的创口愈合率高于胶原蛋白海绵支架组(P<0.05)，在第28天两种海绵支架组大鼠的创口基本愈合完全。见表1及图3。

表1 3组大鼠不同时间点创口愈合率比较(x±s，%)

图3 3组大鼠皮肤创伤愈合情况

2.5 3组大鼠皮肤创口组织的病理学变化比较 造模后，光镜下可见，第7天3组大鼠的创面主要表现为炎症细胞渗出伴随肉芽组织生成；第14天，各组新生组织出现再上皮化，真皮层内可见肉芽组织生长活跃，成纤维细胞及新生血管增多，胶原蛋白海绵支架组和红景天苷-胶原蛋白海绵支架组中的炎症细胞较模型组少，成纤维细胞较模型组多，再上皮化程度较模型组高；第21天，模型组表皮继续增厚，未达完全再上皮化，新生上皮下仍有肉芽组织填充，有少量炎症细胞浸润，胶原蛋白海绵支架组和红景天苷-胶原蛋白海绵支架组基本完全再上皮化，偶见炎症细胞浸润；第28天，3组达完全再上皮化，表皮和真皮分界明显，新生表皮各层分化良好，但红景天苷-胶原蛋白海绵支架组修复效果最佳，其再上皮化形成的新生上皮厚度接近于正常皮肤(P>0.05)，有附属器形成，而模型组及胶原蛋白海绵支架组新生上皮厚度仍厚于正常皮肤(均P<0.05)。见图4及表2。

图4 大鼠皮肤创口组织病理学改变(HE染色，×100)

表2 第28天大鼠皮肤再生上皮厚度(x±s，μm)

3 讨 论

皮肤是人体最大的器官，具有重要的免疫、传感和保护功能。皮肤由于暴露在外界环境中，容易受到各种外界因素的影响，从而导致不同类型的皮肤损伤。在伤口愈合过程中，敷料在伤口处理中具有重要地位，创口敷料的基本功能除了作为一种保护性覆盖物外，还可以加速愈合过程[6]。近年来，随着对药用植物生物活性提取物的应用研究不断深入，越来越多的研究者发现植物源性化合物能够赋予伤口敷料抗氧化和抗菌活性，而这有助于伤口收缩、血管化和上皮化，更能有效地促进急慢性的创口愈合[7-8]。胶原蛋白具有止血性能、良好的生物相容性、可控的生物降解性、低抗原性，能够降低细胞毒性以及刺激细胞附着和生长，被广泛用于伤口敷料和组织工程材料[9]。红景天苷是红景天全草或者根茎中分离出来的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化的作用[10]。因此，本实验将两者相结合，构建装载具有抗氧化能力的红景天苷的胶原蛋白海绵支架，并探究其对皮肤创伤愈合的效果。

本研究中，乙醇渗透法检测结果和扫描电镜图像显示，红景天苷-胶原蛋白海绵支架具有高互联性和高孔隙率，其表面和内部均具有高度互连的多孔结构。这样的多孔结构特性允许氧气、药物、营养物质和代谢废物在细胞间来回运输，有利于细胞的黏附和增殖，能够在吸收伤口渗出液的同时保持湿润环境，从而有利于伤口的恢复[11]。本研究中红景天苷体外释放实验结果表明，红景天苷能够在短时间内完全释放，快速作用于创口部位；同时也说明胶原蛋白海绵支架并不影响红景天苷药物释放，从侧面验证了该支架的高孔隙率结构。胶原蛋白是细胞外基质的主要蛋白质成分，是构成细胞的骨架，有利于细胞存活、增殖和分化，在创面愈合过程中具有重要作用[12]。这些特性表明红景天苷-胶原蛋白海绵支架能够促进创伤愈合。

本研究中，3组大鼠的创口愈合率均随时间延长而增加，且在造模后各个时间点两种海绵支架组的创口愈合率均高于模型组(均P<0.05)，两种海绵支架组创口在造模后第28天基本愈合完全，说明两种海绵支架对皮肤创伤愈合均有良好的促进作用；此外，红景天苷-胶原蛋白海绵支架组在造模后第14天的创口愈合率大于胶原蛋白海绵支架组(P<0.05)，前者的愈合率已接近90%，而后者仍低于80%，提示应用红景天苷-胶原蛋白海绵支架后大鼠的创口愈合速度更快。HE染色结果显示，在造模后第28天3组大鼠达完全再上皮化，新生表皮各层分化良好，但红景天苷-胶原蛋白海绵支架组的再上皮化形成的新生上皮厚度接近正常皮肤(P>0.05)，并有附属器形成，而胶原蛋白海绵支架组的新生上皮结构厚度仍大于正常皮肤(P<0.05)。这提示红景天苷胶原蛋白海绵支架对皮肤创伤的修复效果优于胶原蛋白海绵支架。正常伤口修复是一个动态复杂的过程，需要适宜的环境来促进愈合过程。创伤愈合的生理过程涉及止血期、炎症反应期、增殖期、创面收缩和组织重塑期[13]。创面组织中过量氧自由基能够干扰止血、炎症、血管生成和再上皮化等过程，抗氧化剂是调节创伤愈合的关键分子[14]。本实验制备的红景天苷-胶原蛋白海绵支架是一个三维支架结构，可提供一个保护屏障来保护伤口免受外界湿度和微生物的影响，其多孔结构有利于细胞的黏附和增殖，允许气体交换，同时也提供了细胞外基成分，符合愈合特性[7，15]。此外，红景天苷胶原蛋白海绵支架可同时作为载体，释放具有抗氧化和对损伤修复有一定作用的植物提取物红景天苷[16-17]，发挥其生物特性。因此，红景天苷-胶原蛋白海绵支架对皮肤创伤具有良好的促愈合作用。

综上所述，本实验成功构建红景天苷-胶原蛋白海绵支架，其具有修复皮肤创口及促皮肤再上皮化的潜力，可通过进一步研究和优化以获得理想的皮肤创伤修复支架材料。