复方马红散中羟基红花黄色素A与ZnO的含量测定方法研究

王昭懿 陈扬 邹秦文 顾念念 赵霞 孟雪丹 冯丹 梁瑞强 林瑞超 高达欣

摘要 目的：针对复方马红散中具有抗炎、收湿止痒功效的两味中药红花和炉甘石，分别建立快速、高效、准确的高效液相色谱法及紫外-可见光分光光度法以测定其中羟基红花黄色素A和ZnO的含量，为复方马红散的质量控制提供保障、为其质量标准的建立提供参考。方法：羟基红花黄色素A的含量测定采用Waters XSelect HSS T3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温设置为30 ℃，以乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77）为流动相等度洗脱，流速1.0 mL/min，进样量为20 μL，在403 nm波长下检测。以锌试剂为显色剂，采用改良的紫外-可见光分光光度法在620 nm下测定ZnO的含量。结果：15批复方马红散样品中羟基红花黄色素A的含量范围为8.61～15.31 mg/g。15批复方马红散样品中ZnO的含量范围为82.67～149.40 mg/g。结论：本文基于2020版《中华人民共和国药典》和相关文献，对羟基红花黄色素A、ZnO的含量测定方法进行了一定的优化，经方法学考察，所建立的含量测定方法能快速、准确地测定复方马红散中羟基红花黄色素A、ZnO的含量，对其质量控制及质量标准的制定有一定的参考意义。

关键词 羟基红花黄色素A;ZnO;高效液相色谱法;紫外-可见光分光光度法;含量测定;复方马红散

Abstract Objective：To establish fast，efficient and accurate high performance liquid chromatography（HPLC）methods and UV-Vis spectrophotometry methods to determine the content of hydroxysafflor yellow A and ZnO of Carthamus tinctorius L.and to provide guarantee for the quality control and reference for the establishment of quality standards of Fufang Mahong Powder，and Calamine in Fufang Mahong Powder，which have anti-inflammatory，removing dampness and antipruritic effects.Methods：A Waters XSelect HSS T3 column（250 mm × 4.6 mm，5 μm）was used for the determination of hydroxysafflor yellow A.The column temperature was 30 ℃.Acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution（23∶77）was used as the mobile phase，and the flow rate was 1 mL/min.The injection volume was 20 μL.The detection wavelength was 403 nm.The zinc reagent was used as the chromogenic reagent，and a modified UV-Vis spectrophotometry was used to determine the content of ZnO at 620 nm.Results：The content of hydroxysafflor yellow A was 8.61-15.31 mg/g in 15 batches of Fufang Mahong Powder.The content of ZnO was 82.67-149.40 mg/g in 15 batches of Fufang Mahong Powder.Conclusion：The determination methods of hydroxysafflor yellow A and ZnO have been optimized based on the Chinese Pharmacopoeia（2020 edition）and related literature.Their Hydroxysafflor yellow A; ZnO content of Fufang Mahong Powder can be quickly and accurately determined by the established methods with confirmed methodology.This study has a certain reference significance for the quality control and the establishment of quality standards of Fufang Mahong Powder.

Keywords Hydroxysafflor yellow A; ZnO; High performance liquid chromatography; UV-Vis spectrophotometry; Content determination; Fufang Mahong Powder

中图分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.010

复方马红散是北京泰康园医学研究院研究并开发的院内制剂，其对于类风湿性关节炎具有较好疗效[1]。其药味组成之一的红花是菊科植物Carthamus tinctorius L.的干燥花[2]，具有通经活络、活血化瘀等功效，红花中所含的羟基红花黄色素A是其活血化瘀的主要有效成分[3]，其可以通过激活BK Ca通道并抑制L型Ca通道来诱导血管舒张[4]，并能制JAK2/STAT1通路从而对心肌缺血再灌注损伤、缺血性脑灌注等产生治疗效果[5-6]。除此之外，羟基红花黄色素A同时也具有抗炎、抗氧化等作用，其能抑制MAPK、TNFR1/NF-κB等信號通路，来降低细胞炎性反应因子的表达[7-9]，因此羟基红花黄色素A可能为复方马红散治疗类风湿性关节炎的活性成分之一[10]。

炉甘石为碳酸盐类矿物方解石族菱锌矿，主含碳酸锌（ZnCO3），可解毒明目退翳，收湿止痒敛疮，用于目赤肿痛、睑弦赤烂、翳膜遮睛、胬肉攀睛、溃疡不敛、脓水淋漓、湿疮瘙痒[2]。炉甘石需经过煅制、水飞变为煅炉甘石入药，经过炮制其主要成分由ZnCO3变为ZnO[11]，且炉甘石中ZnO的含量影响其抗菌活性[12]。因此，炉甘石所含的ZnO可能也是复方马红散的有效成分之一。

目前对于复方马红散中羟基红花黄色素A、ZnO的含量测定方法及质量标准尚不明确。本实验首次建立了复方马红散中羟基红花黄色素A、ZnO的含量测定方法，并通过该方法测定了15批复方马红散样品中羟基红花黄色素A及ZnO的含量，以期为该制剂的质量标准制定提供参考和依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电子分析天平（梅特勒-托利多公司，瑞士，型号：MS105DU）;医用数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-250DE）;高效液相色谱仪（包括2695四元梯度泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱，2998 PDA紫外检测器，Empower 3.0色谱工作站，沃特世科技（上海）有限公司，美国，型号：2695型）;Waters XSelect HSS T3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）[沃特世科技（上海）有限公司，美国，型号：XSelect HSS T3];双光束紫外可见分光光度计（日立高新技术公司，日本，型号：UH5300型）;雷磁pH计（上海仪电科学仪器有限公司，型号：PHS-3C）;大容量低温离心机（北京时代北利离心机有限公司，型号：GTR10-2）。

1.2 试剂

甲醇为分析纯（北京化工厂，批号：20180622）;乙腈和磷酸均为色谱纯（美国Fisher公司）;水为去离子水;盐酸为分析纯（北京化工厂，批号：20180901）;硼酸为分析纯（北京化工厂，批号：20180216）;氯化钾为分析纯（北京化工厂，批号：20170801）;氢氧化钠为分析纯（北京化工厂，批号：20171106）;锌试剂为分析纯（天津市大茂化学试剂厂，批号：20180223）;锌试液（自行配制：取锌试剂0.13 g，加氢氧化钠试液2 mL溶解，加水定容至100 mL）;羟基红花黄色素A对照品（批号：PS0325-0025，纯度>98%）购自成都普思生物科技有限公司;ZnO对照品（批号：111619-200301）购自中国食品药品检定研究院。

1.3 分析样品

实验所用各批次样品由北京泰康园医学研究院提供。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱法

2.1.1 色谱条件 采用Waters XSelect HSS T3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱温为30 ℃;以乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77）为流动相进行等度洗脱，流速设为1.0 mL/min;检测波长为403 nm;进样量为20 μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加25%甲醇制成每1 mL含0.13 mg的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入25%甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）40 min，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，4 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.1.4 线性关系考察 精密移取不同体积的对照品溶液，分别置25 mL容量瓶中，用25%甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成不同浓度的对照品溶液，分别进样测定其峰面积。以各浓度对照品溶液中羟基红花黄色素A的含量X（μg）为横坐标，以峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归分析。如表1所示，羟基红花黄色素A在0.087～1.30 μg范围内线性良好。

2.1.5 精密度试验 取同一份样品溶液，连续测定六次，记录峰面积，以六次峰面积分别计算样品含量，再计算RSD值。经计算，RSD为0.49%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.1.6 供试品溶液稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8、10、12、18、24 h进样分析，测定峰面积，分别计算出样品含量，再计算RSD值。计算得RSD为1.45%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 取同一批次样品，平行制备六份供试品溶液，以六个峰面积值分别计算含量，再计算RSD值。经计算RSD为1.96%（n=6），表明重复性良好。

2.1.8 回收率试验 取同一批已知含量的复方马红散样品6份，每份约0.05 g，精密称定，分别精密加入羟基红花黄色素A对照品适量，按“2.1.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，并计算加样回收率和RSD值。由表2可知，六次加样回收试验的平均回收率为103.33%，RSD为1.18%，表明方法准确、可靠。

2.1.9 样品测定结果 取各批次复方马红散，每批次平行制备两份供试品溶液，每份供试品溶液分别进样两次，测定峰面积，计算各批次样品中羟基红花黄色素A的含量。供试品溶液色谱图如图1所示，各批次样品含量见表3。

2.2 紫外-可見光分光光度法

2.2.1 空白试液的制备 精密吸取5 mL稀盐酸，置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度。

2.2.2 阴性对照液的制备 称取不含炉甘石的复方马红散阴性样品约0.08 g，精密称定，精密加入20 mL稀盐酸，振摇，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）5 min使样品溶解，4 000 r/min，离心半径28.94 cm，离心10 min，精密吸取5 mL上清液，置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度线。

2.2.3 对照品溶液的制备 称取ZnO对照品8.38 mg，置于100 mL容量瓶中，精密加入5 mL稀盐酸，振摇使溶解，加水定容至刻度线。

2.2.4 供试品溶液的制备 称取0.1 g复方马红散各批次样品，精密称定，精密加入20 mL稀盐酸，振摇，超声处理（功率300 W，频率50 kHz）5 min使样品溶解，4 000 r/min，离心半径28.94 cm，离心10 min，精密吸取5 mL上清液，置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度线。

2.2.5 显色与测定 精密吸取空白溶液、阴性对照液、对照品溶液、供试品溶液各2 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，精密加入10 mL硼酸-氯化钾缓冲液（pH值9.0）及3 mL锌试液，加水定容至刻度，摇匀，于620 nm处测定吸光度。

2.2.6 专属性试验 对阴性对照液及供试品溶液进行全波长扫描。图2为供试品溶液（绿色）与阴性对照液（蓝色）的全波长扫描图。由图可知，供试品溶液的最大吸收波长为620 nm，在该波长下，复方马红散中其他成分对ZnO的检测无干扰，因此选择此波长作为检测波长。

2.2.7 线性关系考察 精密移取不同体积的ZnO对照品溶液，分别置于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度线，摇匀，配制成不同浓度的对照品溶液，分别于620 nm处测定其吸光度。以ZnO浓度X（mg/mL）为横坐标，以吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归分析。由表4可知，ZnO在0.67～2.01 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2.8 精密度试验 取同一份供试品溶液，连续测定六次，记录吸光度值，以吸光度值分别计算ZnO含量，再计算RSD值。经计算，ZnO含量的RSD为0.10%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.9 供试品溶液稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、8 h测定吸光度值，计算样品中ZnO含量，再计算RSD值。计算得RSD为1.44%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.2.10 重复性试验 取同一批次样品，平行制备6份供试品溶液，以吸光度值分别计算ZnO含量，再计算RSD值。经计算，RSD为1.10%（n=6），表明重复性良好。

2.2.11 回收率试验 称取已知含量的某一批次复方马红散样品6份，每份约0.05 g，精密称定，分别精密加入适量ZnO对照品，按“2.2.4”项下方法制成供试品溶液，按“2.2.5”项下方法显色并检测，计算加样回收率和RSD值。由表5可知，六次加样回收试验的平均回收率为99.93%，RSD为0.78%，表明方法准确、可靠。

2.2.12 样品测定结果 取15批复方马红散样品，各批次按“2.2.4”项下方法平行制备两份供试品溶液，每份供试品溶液按“2.2.5”项下方法测定两次，记录吸光度值，计算各批次样品中ZnO的含量。样品含量测定见结果表6，各批次样品中ZnO含量范围为82.67～149.40 mg/g。

3 讨論

2020版《中华人民共和国药典》[2]对红花中羟基红花黄色素A的含量测定项规定采用甲醇-乙腈-0.7%磷酸（26∶2∶72）作为流动相。然而此方法中磷酸的浓度较高，比较容易堵塞色谱柱，损坏仪器，因此本研究采用了乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77）作为流动相，可以实现羟基红花黄色素A与其他成分的有效分离，能够完成其含量测定。由于复方马红散中含有一些极性较小的成分，所以实验前期尝试采用常压或减压过滤方式过滤药液，但是均导致提取液的大量损失。因此后续采用离心的方式分离药液。采用本方法制样并进行测定，供试品溶液在24 h内稳定，样品出峰较快，精密度、重复性、回收率试验的RSD均能满足测定要求。通过所建立的含量测定方法对15批复方马红散中羟基红花黄色素A的含量进行测定，15批复方马红散中羟基红花黄色素A的含量范围是8.61～15.31 mg/g。

2020版《中华人民共和国药典》[2]中，采用络合滴定法对炉甘石中ZnO的含量进行测定，但该法的样品前处理较为繁琐，滴定终点不易判断，对实验人员的技术操作水平要求较高。此外，复方马红散中所含的红花颜色较深，制成供试品溶液后会干扰滴定终点的判断，因此采用络合滴定法难以实现其中ZnO的含量测定。经过查阅文献，作者发现已有采用紫外-分光光度法对炉甘石药材、饮片、洗液或其他制剂中ZnO进行含量测定的报道[13-17]。但已报道文献中[13-17]，供试品溶液的制备均需要三次的定容步骤才可进行最终测定，且采用滤纸分离药液与药渣有一定的损失。作者经过改良设计，以离心代替过滤，将三次定容改为两次定容，从而有效地减少了前处理过程中供试品的损失、提高了供试品溶液制备的效率、增强了方法的准确性与重复性。此方法经过方法学考察，具有良好的专属性、准确性与稳定性。基于已建立的方法，测得15批次复方马红散样品中ZnO含量在82.67～149.40 mg/g。实验中显色步骤所用的锌试液需现配现用、避光保存;显色后的对照品及供试品溶液也需避光保存、尽快测定。

4 结论

本实验根据2020年版《中华人民共和国药典》及相关文献，对羟基红花黄色素A和ZnO的含量测定方法进行了一定的优化。经各项方法学考察验证，所建立的2种含量测定方法可分别用于复方马红散中羟基红花黄色素A、ZnO含量的测定，可实现对不同批次复方马红散样品的质量控制，对复方马红散质量标准的建立有一定的参考价值。

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（2020-06-10收稿 责任编辑：徐颖）