微生物源谷氨酰胺转氨酶对干贝嫩化作用的研究

王飞飞，王徐媛，杨仁迪，潘童，傅玲琳，2，王彦波，2，*

（1.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310018；2.浙江工商大学浙江食品质量安全工程研究院，浙江杭州310018）

干贝，是由扇贝的后闭壳肌脱水干制而成，别名瑶柱、马甲柱，甲带子等。干贝营养丰富，富含蛋白质、矿物质，且脂肪含量较低，风味独特，不仅腥味大减，还具有干贝特有的肉香味，是国际公认的高档水产品，被列入八珍之一，具有重要的使用价值和经济价值[1]。但干贝质地较硬，咀嚼性能较差，软化处理繁琐耗时，一定程度上影响其市场推广。

谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TG）是一种催化酰基转移的酶，能促进限制性氨基酸的引入，蛋白质交联以及蛋白质等电点和溶解性的改变[2]。相较于动植物来源，微生物源谷氨酰胺转氨酶（microbial transglutaminase，MTG）因其更容易生产，且具有较优的酶学特性，如反应最适pH值范围广、热稳定性强、酶活性不依赖Ca2+、受酶抑制剂和金属离子的影响小、底物特异性低等优点[3-4]，被广泛应用于促进肉制品的黏结、乳制品的乳化[5-7]。但其在干贝的肉质嫩化研究上，至今鲜有报道。

本研究通过测定质构特性，蒸煮损失，可溶性蛋白含量以及感官评价研究茂源链霉菌源谷氨酰胺转氨酶处理的各个因素对干贝嫩度的影响，通过响应面试验确定最优嫩化条件，为干贝嫩化工艺提供试验参数，对提高干贝食用品质及商业价值具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干贝：福建莆田海鲜批发中心，每粒质量为1.5 g～3 g，置于4℃冷藏备用；谷氨酰胺转氨酶（食品级）（200 000 U/g，产自茂源链霉菌）：东恒华道生物科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾、五水硫酸铜、碘化钾、四水合酒石酸钾钠：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；盐酸：国药集团药业有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）：天津灏洋华科生物科技有限公司；牛血清白蛋白：生工生物工程上海有限公司。以上化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AB135-S型电子天平、DELTA 320型pH计：瑞士METTLER TOLEDO公司；DHG-9143BS-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗公司；Milli-Q超纯水装置：美国MILLIPORE公司；CT3质构仪：美国BROOKFIELD公司；AZ8852温度计：台湾衡欣公司；WI1102型旋涡振荡器：中国东西仪科技有限公司；HH系列-1型数显恒温水浴锅：中国聚创环保公司；DL-1-15万用电炉：中国泰斯特公司；Spectra Max i3型酶标仪：美国MOLECULAR DEVICES公司；Allegra X-3012台式冷冻高速离心机：美国BECKMAN COULTER公司。

1.3 方法

1.3.1 单因素试验

将干贝清洗干净，挑选大小均匀且质量为（3±0.2）g的干贝，每3粒干贝为一个试验样本，每个样本质量（9±0.5）g。

配置pH 6.0的磷酸缓冲液，将其置于50℃的电热鼓风干燥箱备用。用pH 6.0，温度为50℃的磷酸缓冲液配置浓度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的谷氨酰胺转氨酶溶液。将干贝浸没在酶溶液中20 min，期间控制环境温度为50℃。将酶处理后的干贝置于真空蒸煮袋中，沸水浴10 min。随后，进行质构分析。

用0.1 mol/L盐酸和0.1 mol/L氢氧化钠调节磷酸缓冲液分别为 pH 值为 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，分别溶解得到0.6%谷氨酰胺转氨酶溶液，并控制温度为50℃。将干贝浸没在酶溶液中20 min，期间控制环境温度为50℃。酶处理完成后，将干贝置于真空蒸煮袋中，沸水浴10 min。随后，进行质构分析。

配置 pH6.0 的磷酸缓冲液，将其置于 40、50、60、70、80℃的环境中。将干贝浸没在0.6%酶溶液中20 min。酶处理完成后，将干贝置于真空蒸煮袋中，沸水浴10 min。随后，进行质构分析。

1.3.2 响应面试验

基于单因素试验的结果，固定嫩化时间为20 min，沸水浴时间为10 min，利用Design-Expert.8.05进行三因素三水平的Box-Behnken试验设计。选取的3个因素为酶用量、pH值和温度，对应的响应指标为弹性。Box-Behnken试验设计的因素及水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素及水平表Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of the optimization parameters used in Box-Behnken experimental design

1.3.3 感官评价

参照国标GB/T 12310-2012《感官分析方法成对比较检验》[8]中规定的感官评价——成对比较检验流程，运用定向成对比较检验方法，对嫩化后的干贝进行感官分析。邀请30位具有一定感官品评经验的试验人员组成品评小组，把试验组和对照组的干贝样品记编号330和550，并按照330、550的顺序随机呈递给15位品评员，同时按550、330的顺序呈递给另外15名品评员。并要求品评员对干贝的硬度和弹性做差异性评价。

1.3.4 蒸煮损失

用电子天平分别称量试验组和对照组的干贝质量，记为M1，随后将样品分别放入真空蒸煮袋中，沸水浴40 min[9]。取出后用滤纸吸干表面水分后，称取蒸煮后的质量记为M2。每组平行3次。蒸煮损失率的计算公式如下：

蒸煮损失率/%=（M1-M2）/M1×100

1.3.5 可溶性蛋白含量测定

可溶性蛋白含量是评价肉嫩度的重要指标[10-11]。在周丹等[12]的测定方法基础上稍作修改，取嫩化后的（9±0.5）g干贝剪碎，并加入PBS缓冲液50 mL，用均质机将干贝绞碎，搅拌均匀后倒入50 mL离心管中，在4℃下离心30 min，转速为8 500 r/min。离心后取上清液 1 mL，并加入双缩脲试剂（CuSO4·5H2O 4 g，KI 4.4 g，KOH 28 g，酒石酸钾钠 13.4 g）4 mL，在 25℃室温下避光放置20 min。取200 μL置于96孔板中。利用酶标仪测定波长为540nm处，样品的吸光度值，记为A540nm。每组平行测 3 次。以 0、2、4、5、6、8、10 mg/mL 牛血清白蛋白标准液制作标准曲线，得回归方程为y=0.025 6x+0.071 2，R2=0.999 6。

1.3.6 质构分析

用滤纸吸干酶处理后的干贝表面水分，通过CT3质构仪对其进行弹性和咀嚼性的测定。质构分析条件参数[13]如下：探头类型：TA10；预测试速度：2.0 mm/s；测试速度：1 mm/s；探头回程速度：1 mm/s；测试距离：6 mm；触发力：1 g；数据采集速率：100.0 points/s。

1.3.7 数据统计与分析

结果取6次平行试验的平均值，以平均值±标准差表示，采用 Origin 8.1、GraphPad Prism 7.00、Design-Expert 8.0.6和SPSS 17.0统计软件进行数据处理，差异显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶用量对质构特性的影响

酶用量对干贝质构特性的影响见图1。

图1 酶用量对干贝质构特性的影响Fig.1 Effects of different enzyme doses on the texture properties of scallops

由图1可知，当加酶量浓度低于0.8%时，随着谷氨酰胺转氨酶浓度的增加，咀嚼性不断降低，弹性不断增强，当加酶量达到0.8%时，弹性增加约20%，咀嚼性降低25%，接着干贝弹性和咀嚼性趋于稳定。结果表明，添加酶的最适浓度在0.6%～0.8%之间。由于谷氨酰胺转氨酶能够催化肽链中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与受体之间进行酰基转移，加强蛋白质交联，改善蛋白质溶解性从而影响干贝的咀嚼性和弹性[14-15]，因此在底物蛋白充足时，随着谷氨酰胺转氨酶浓度的增加，干贝嫩化效果提升明显，随后嫩化效果随着底物逐渐交联最终达到平衡。

2.1.2 pH值对质构特性的影响

pH值对干贝质构特性的影响见图2。

图2 pH值对干贝质构特性的影响Fig.2 Effects of pH value on the texture properties of scallops

如图2所示，随着pH值的增加，干贝的咀嚼性逐渐减小后增大，弹性逐渐增大后减小。当pH值达到7时，弹性达到最大，增加43%，咀嚼性达到最小，降低20%。结果表明，谷氨酰胺转氨酶嫩化干贝的最适pH值为7，这符合茂源链霉菌源谷氨酰胺转氨酶的最适 pH 6～7 的性质[16-18]。

2.1.3 温度对嫩化效果的影响

温度对干贝质构特性的影响见图3。

图3 温度对干贝质构特性的影响Fig.3 Effects of temperature on texture properties of scallops

由图3可知，当温度在30℃～60℃之间时，干贝弹性逐渐增大，咀嚼性逐渐减小，当温度高于60℃时，干贝的弹性和咀嚼性则分别减弱和增强。结果表明，酶处理的最适温度为60℃。该结果与孙高军等[19]对谷氨酰胺转氨酶最适作用温度的探究结果基本一致。这是因为温度的适度升高能促进谷氨酰胺转氨酶活性位点—催化三联体“Cys64-His255-Asp274”的暴露，但温度过高会造成谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TG）以及干贝本身所含有的蛋白质不同程度的变性，因而影响嫩化效果[20-22]。

2.2 响应面试验结果

以谷氨酰胺转氨酶用量（X1）、pH 值（X2）、温度（X3）为试验因素，对应的响应指标为弹性，进行三因素三水平的Box-Behnken试验。

响应面试验水平及结果见表2。

表2 响应面试验水平及结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

利用Design-Expert.8.05对试验数据进行方程的回归拟合，得到结果如下：Y=-0.028X1+0.15X2-0.038X3-0.042X1X2-0.05X1X3+0.18X2X3-0.27X12-0.28X22-0.22 X32+4.90

回归方程的各因素方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variances of the developed regression model

续表3 回归模型方差分析Continue table 3 Analysis of variances of the developed regression model

如表3所示，该模型的P＜0.05，说明该回归模型显著。失拟项P值为0.137 1，说明相对于绝对误差该模型不显著。并且，相关系数R2=0.846 9，表明该回归模型与数据的拟合度较高，即预测的准确度也相应较高。其中，模型的 X2、X12、X22、X32的 P＜0.05，说明这几项对于弹性增强的影响极为显著。但X1酶用量，X3温度，交互项X1X2，X1X3，X2X3对于该回归模型影响不显著。

各因素交互关系的响应曲面及等高线见图4。

图4 各因素交互关系的响应曲面及等高线图Fig.4 Response surface and contour map of interaction of various factors

由图4A可知，固定酶用量，pH值在5到7的范围内变化时，弹性变化较为明显，先增大后减小。与之相比，弹性强度随加酶量增加强度变化较小。结果表明，相同条件下pH值对于干贝嫩化的作用强于酶用量。等高线图表征两者的交互作用。如图4B所示，改变相同的弹性强度，酶用量与pH值改变量基本相等，即两者的交互作用并不明显。方差分析中X1X2对应的P值为0.658 8＞0.05，两者交互作用不显著，两项分析结果一致。由图4C可知，当温度确定时，pH值的立体图整体趋势更陡，且单因素方差分析结果显示pH值的显著性（P=0.049 3）大于酶用量（P=0.676 6）。此外，方差分析结果显示X2X3所对应的P值为0.05＜0.093 6＜0.1，且图D等高线图呈现椭圆形，说明pH值与酶用量之间存在一定的交互作用。由图4E可知，温度与pH值的立体图整体趋势较为平缓，表明温度，pH值这两个因素对于弹性大小的影响皆不显著。相比之下，温度对应的曲面更为陡峭，即温度的影响略大。图4F的等高线图虽呈椭圆形，但其离心率接近1，即两个因素的交互作用不明显。综上，3个因素对于弹性的影响从大到小依次为：pH值＞温度＞酶用量。

根据多元二次函数，3个因素的一阶偏导数∂X1、∂X2、∂X3，进而求得响应值的最优值以及此时对应的X1、X2、X3。软件模拟得出，当 X1为 0.58%，X2为 6.29，X3为50.42℃时，弹性值达到最大，为4.92 mm。在这个最优条件下，做验证试验，得到干贝实际弹性值为（4.91±0.41）mm，与预测值4.92 mm相符。

2.3 嫩化作用验证试验结果

2.3.1 成对比较结果分析

干贝感官差异性结果见图5。

图5 干贝感官差异性结果图Fig.5 The sensory results of scallop samples

如图5所示，有25名认为330样品（试验组）弹性更强，有21名认为550（对照组）硬度更大。参考国标GB12310-2012《感官分析 成对比较检验》，当品评人数为30人，P=0.05时，其中一项被选择多于20次，说明两个测试样品之间有明显差异。结果表明，经微生物源谷氨酰胺转氨酶（microbial transglutaminase，MTG）在最优条件下嫩化后的干贝与未经任何处理干贝在弹性和硬度上能明显被消费者感知出差异，说明MTG酶的作用能较好地改善产品的感官品质。

2.3.2 理化指标的差异性分析

理化指标差异性结果见图6。

图6 理化指标差异性结果图Fig.6 The physical and chemical results of MTG treated samples

MTG酶的添加有效降低了干贝的蒸煮损失，减少了可溶性蛋白含量，减小咀嚼所需的力度，同时增强了干贝的弹性，嫩化效果显著。这是因为谷氨酰胺转氨酶能够催化酰基转移，促进分子之间的共价键形成，进而增强了氨基酸之间的交联，使得游离在溶质中的蛋白质含量降低，蒸煮损失减少[23-24]。Afshari R等[25]学者在探究MTG对小麦蛋白的作用机理时也得到了相应的结论。再者，蛋白质的交联能够促进体系形成致密的三维结构，类似于面制品中的面筋网络，能够改善整个体系的质构特性，包括弹性和咀嚼性。此外，在响应面试验得到的最优条件下对干贝进行酶处理，实际得到的干贝弹性值为（4.91±0.41）mm，与预测结果4.92 mm基本一致，再次证明回归模型的科学性和可靠性。

3 结论

本研究基于酶用量、pH值、处理温度3个因素，利用Box-Behnken试验设计基于弹性指标优化得到微生物源谷氨酰胺转氨酶最佳作用条件为：酶用量0.58%，pH 6.29，温度50.41℃。控制酶用量0.58%，pH 6.29，温度50.4℃，进行酶处理验证试验，与未经处理的干贝相比，感官品质存在显著差异，同时弹性提高19%，咀嚼性降低27%，蒸煮损失减少68%，可溶性蛋白含量增加38%，干贝的感官品质得到了明显的改善。本研究为干贝嫩化工艺提供参数，并为微生物源谷氨酰胺转氨酶在海产品中的应用提供技术支持。