EoNPV对茶尺蠖两近缘种的毒力差异

李 红，唐美君，郭华伟，王志博，肖 强，*

(1.中国农业科学院 茶叶研究所，浙江 杭州 310008； 2.中国农业科学院 研究生院，北京 100081； 3.农业农村部茶叶质量安全控制重点实验室，浙江 杭州 310008)

茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropisobliquanucleopolyhedrosis virus，EoNPV)是茶尺蠖的重要病原微生物，于1977年在我国安徽茶园首次发现[1]，隶属于杆状病毒科(Baculoviridae)，α-杆状病毒属(Alphabaculovirus)[2]。由于茶尺蠖核型多角体病毒能够在茶园中长期存在，并且对茶尺蠖幼虫有较高的致病力[3]，近些年科研工作者在利用EoNPV防治茶园中的茶尺蠖方面做了大量的研究，开展了以EoNPV作为主要成分的生物农药制剂研制，目前已登记成生物农药产品并进行了大面积示范应用，已成为茶园中茶尺蠖生物防治的主要措施[4-5]。

茶尺蠖(EctropisobliquaProut，1915)和灰茶尺蠖(EctropisgrisescensWarren，1894)是一对近缘种茶树害虫[6-7]，均隶属于鳞翅目(Lepidoptera)尺蠖蛾科(Geometridae)灰尺蛾亚科(Ennominae)埃尺蛾属(Ectropis)，主要以幼虫取食茶树叶片为害，严重时甚至导致茶树死亡[8-9]，对茶叶产量和品质造成影响。二者形态特征极为相似，过去一直被统称为茶尺蠖。

在田间调查茶尺蠖的防治效果过程中发现，EoNPV对不同地理种群茶尺蠖的防治效果差异较大[10]。基于这一现象，姜楠等[6]采用昆虫形态学和分子生物学相结合的方法，研究明确了我国茶园中存在茶尺蠖和灰茶尺蠖两近缘种。随着研究的不断深入，目前茶尺蠖两近缘种在我国茶园中的地理分布已基本明确。茶尺蠖和灰茶尺蠖具有相对独立的分布区域，同时还存在混发区；灰茶尺蠖的分布较茶尺蠖更广，茶尺蠖主要分布在浙江、江苏和安徽三省，在浙江的富阳、临安，安徽的宣城，江苏的溧阳等5个地区是两近缘种的混发区[11-12]。

现有的研究表明，EoNPV可以感染茶尺蠖和灰茶尺蠖，但EoNPV对这两近缘种的毒力差异尚不清楚，且前期均采用浸叶法测定EoNPV对茶尺蠖和灰茶尺蠖的半致死浓度LC50(median lethal concentration)[10，13]。本研究首次采用叶盘法测定了EoNPV对茶尺蠖两近缘种的半致死剂量LD50(median lethal dose)和致死中时间LT50(median lethal time)，并比较了EoNPV对茶尺蠖和灰茶尺蠖的毒力差异，可为EoNPV的后续研究，特别是指导EoNPV田间防控茶尺蠖和灰茶尺蠖提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫

茶尺蠖幼虫采集于浙江省杭州市余杭区茶园(119.90°E，30.39°N)，灰茶尺蠖幼虫采集于广西茶园(110.36°E，25.30°N)，室内饲养繁殖至少3代。实验幼虫饲养环境为温度(24±1)℃，光周期为13 h/11 h(L/D)，湿度(75±5)%。

1.2 EoNPV病毒液

试验所用茶尺蠖病毒为中国农业科学院茶叶研究所实验室保存的病毒毒株经增殖提纯后低温保存备用的病毒原液。

1.3 毒力测定方法

根据预试验的结果，设置5个EoNPV剂量处理，即2×103、2×104、2×105、2×106、2×107PIB·头-1，采用叶盘饲毒法进行。先将病毒原液用蒸馏水梯度稀释成5个不同浓度：即2×105、2×106、2×107、2×108、2×109PIB·mL-1，以蒸馏水作为对照。然后将茶树嫩叶片用圆形打孔器制成直径为9 mm的叶盘，用移液枪分别吸取10 μL上述不同浓度的病毒液滴至叶盘上，并将带病毒的叶盘置于底部铺有湿润滤纸的培养皿中，于通风处晾干。挑选3龄初期幼虫，饥饿处理6 h后，将带病毒的叶盘和幼虫同时转移至24孔板中，取食8 h后，挑出食尽叶盘的幼虫，转移到玻璃瓶中用无病毒叶片饲养作为试验用虫，每个浓度处理试验虫数不少于60头。每天记录死亡虫数至试验用虫全部死亡或化蛹。饲养温度(24±1)℃，光周期为13 h/11 h(L/D)，湿度(75±5)%。

1.4 数据统计与分析

使用Excel统计各处理试验用虫的累计死亡虫数与累计死亡率，使用SPSS进行显著性分析。使用DPS软件计算各处理的半致死剂量(LD50)和致死中时间(LT50)。

2 结果与分析

2.1 茶尺蠖两近缘种感染EoNPV后的死亡动态

EoNPV不同剂量(2×103、2×104、2× 105、2×106、2×107PIB·头-1)处理茶尺蠖和灰茶尺蠖3龄幼虫的死亡率如图1、图2所示。结果显示，EoNPV的使用剂量与茶尺蠖和灰茶尺蠖的死亡率呈正相关，病毒的使用剂量越高，死亡率也越高。在相同剂量处理下，饲喂病毒相同天数之后，茶尺蠖的死亡率要高于灰茶尺蠖。在2×103PIB·头-1的剂量处理下，茶尺蠖在饲毒后第7天开始死亡，而灰茶尺蠖在饲毒后第10天开始死亡，与茶尺蠖相比灰茶尺蠖在最低剂量病毒处理下开始死亡时间迟了3 d。而在2×104、2×105、2×106、2×107PIB·头-14个剂量处理时，相同处理剂量下，灰茶尺蠖开始死亡时间均比茶尺蠖迟1 d。在试验的最高剂量2×107PIB·头-1处理下，茶尺蠖幼虫在饲毒后第10天时全部死亡，而灰茶尺蠖幼虫在第10天的死亡率为65%，相同剂量的病毒处理后茶尺蠖幼虫的死亡率高于灰茶尺蠖，这说明EoNPV对茶尺蠖的致病力高，而对灰茶尺蠖的致病力低于茶尺蠖。

2.2 EoNPV对茶尺蠖两近缘种的LD50和LT50

EoNPV对茶尺蠖和灰茶尺蠖3龄幼虫的半致死剂量LD50如表1所示。结果显示，EoNPV处理茶尺蠖的LD50为1.24×105PIB·头-1，EoNPV处理灰茶尺蠖的LD50为3.58×106PIB·头-1，灰茶尺蠖的LD50是茶尺蠖的28.9倍。这表明在同样的环境条件下，灰茶尺蠖幼虫被茶尺蠖病毒感染后半数个体死亡所需要的剂量是茶尺蠖的28.9倍。茶尺蠖病毒处理茶尺蠖和灰茶尺蠖3龄幼虫的致死中时间LT50如表2所示。不同剂量处理下幼虫的平均死亡率与标准差如表2所示， 2×105、2×106、2×107PIB·头-13个剂量处理间茶尺蠖幼虫的平均死亡率没有显著差异，与2×103和2×104PIB·头-1剂量处理下幼虫的平均死亡率存在显著差异。茶尺蠖病毒不同剂量处理灰茶尺蠖的平均死亡率间的显著性与茶尺蠖的一致，但茶尺蠖的LT50均小于灰茶尺蠖，在2×107PIB·头-1剂量处理下，灰茶尺蠖的致死中时间约为茶尺蠖的2倍，在2×106PIB·头-1剂量处理下，灰茶尺蠖的致死中时间约为茶尺蠖的1.35倍。表明茶尺蠖病毒对茶尺蠖的毒力高于对灰茶尺蠖的毒力。

图1 EoNPV处理后茶尺蠖的死亡动态Fig.1 Death dynamics of E. obliqua after feeding with EoNPV

图2 EoNPV处理后灰茶尺蠖的死亡动态Fig.2 Death dynamics of E. grisescens after feeding with EoNPV

3 结论与讨论

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)自首次在安徽茶园发现后，作为茶尺蠖的专一性病原微生物开展了系统研究，在EoNPV对茶尺蠖的毒性、安全性、田间防效等方面均取得了较好的进展[14-16]。目前茶尺蠖病毒杀虫剂已进入大面积推广应用阶段，在茶尺蠖生物防治中起到了重要的作用。通常昆虫核型多角体病毒具有较强的宿主专一性，一种病毒只能感染一种昆虫，但也有部分昆虫病毒是可以同时感染多种害虫，如MabrMNPV(甘蓝夜蛾核型多角体病毒)可以感染多种夜蛾科昆虫[17]。茶尺蠖和灰茶尺蠖是近年来研究明确的茶园害虫两近缘种，也是茶园最主要的食叶类害虫[6]。本研究进一步明确了EoNPV可以同时感染茶尺蠖和灰茶尺蠖，这一结果也拓展了EoNPV的宿主范围。

表1 EoNPV对茶尺蠖两近缘种的LD50值

表2 EoNPV处理茶尺蠖两近缘种后的平均死亡率及LT50值

前期在研究EoNPV对茶尺蠖毒力时均采用浸叶法[10，13，16]，浸叶法在叶片处理和喂饲过程相对方便，但浸叶法只能获得病毒对宿主的LC50，无法精确到每头幼虫取食病毒的量。本研究首次采用叶盘法对茶尺蠖两近缘种进行病毒饲喂处理，可以相对精准地掌握每头幼虫取食的病毒数量，获得EoNPV对茶尺蠖和灰茶尺蠖的LD50，从而探索建立了病毒对茶树害虫毒力评价的一种新方法。相对而言，采用叶盘法评价病毒对宿主的毒力的要求更加严格，特别是要掌握好害虫的虫龄和饲养的环境温度[18]。选择相对适合的虫龄可以在预期时间将叶盘全部食尽，从而保证喂饲病毒的数量。饲养的环境则决定着在病毒繁殖周期内是否能有效死亡，进而较好地获得病毒作用宿主的不同死亡率。

尽管EoNPV可以同时感染茶尺蠖和灰茶尺蠖，但结果表明其对茶尺蠖与灰茶尺蠖的敏感性存在明显差异，灰茶尺蠖的LD50是茶尺蠖的28.9倍，可以看出EoNPV对茶尺蠖更为敏感。杆状病毒和宿主的相互作用机制是一个复杂的过程，既与病毒的基因表达相关，也与宿主的抵御机制关联。Hou等[19]利用MabrMNPV感染棉铃虫和甜菜夜蛾，结果表明，病毒感染不同的昆虫宿主后ODV和BV具有不同的特异蛋白质成分，这可能是宿主对病毒基因表达的响应。Katsuma等[20]发现，若发生基因突变的BmNPV病毒其FP25K发生了突变，此病毒感染家蚕幼虫后死亡虫尸的液化程度比感染野生型病毒而死亡的虫尸低，而且半致死量(LD50)比野生型病毒的高1 000倍，反映出不同病毒毒株对宿主的作用存在差异。而作为近缘种的灰茶尺蠖和茶尺蠖对同一病毒的毒力差异机制尚不清楚，后续有必要作进一步的深入研究。